NE介導(dǎo)的PML-RARα融合蛋白裂解產(chǎn)物在APL發(fā)生中的分子機制研究.pdf

1、第一部分NLS-RARα與JTV1蛋白的細胞內(nèi)共定位實驗 目的：利用間接免疫熒光技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察NLS-RARα和JTV1蛋白在哺乳動物細胞內(nèi)是否共定位表達。 方法：構(gòu)建真核細胞表達載體pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTV1，經(jīng)酶切鑒定后，共轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞，利用間接免疫熒光技術(shù)研究它們的表達是否存在細胞內(nèi)共定位。 結(jié)果：構(gòu)建的重組表達載體pCMV-HA-NLS-RARα和pC

2、MV-Myc-JTV1經(jīng)酶切鑒定成功，轉(zhuǎn)染HEK293細胞。HA-NLS-RARα蛋白用抗HA的一抗和FITC結(jié)合的羊抗鼠IgG標記，Myc-JTV1蛋白用抗Myc的一抗和Cy3結(jié)合的羊抗兔IgG標記，激光共聚焦顯微鏡下可觀察到兩種蛋白的共定位表達。 結(jié)論：成功構(gòu)建真核表達載體pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTV1，在HEK293細胞表達后利用間接免疫熒光技術(shù)證實NLS-RARα和JTV1蛋白在核內(nèi)可共定位

3、表達，從而進一步提示二者在細胞核內(nèi)存在相互作用的可能。 第二部分早幼粒細胞白血病基因PML變異蛋白全長及其結(jié)構(gòu)域誘餌載體的構(gòu)建及鑒定 目的：為研究中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）酶切PML-RARα融合蛋白后產(chǎn)生的早幼粒細胞白血病基因（PML）的變異蛋白和其中含環(huán)指/B-BOX結(jié)構(gòu)與含coiled-coil結(jié)構(gòu)的兩個結(jié)構(gòu)域的功能，構(gòu)建含其變異蛋白全長及結(jié)構(gòu)域序列的誘餌表達載體，為進一步應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選與之相互作用的蛋白

4、建立實驗基礎(chǔ)。 方法：PCR擴增mut-PML全長及其兩個結(jié)構(gòu)域序列，克隆入誘餌載體pGBKT7中，經(jīng)測序鑒定后，將誘餌載體轉(zhuǎn)化到酵母細胞AH109中，檢測誘餌蛋白有無毒性，滲漏和自激活作用，同時利用蛋白印跡法分析誘餌蛋白的表達。 結(jié)果：成功擴增mut-PML全長及其兩個結(jié)構(gòu)域的基因片段，并正確克隆入pGBKT7中。誘餌載體成功轉(zhuǎn)化到酵母細胞AH109中，其中誘餌蛋白BD-mut-PML，BD-PML-B無毒性，但具有滲

5、漏和自激活作用，誘餌蛋白BD-PML-C無毒性，滲漏和自激活作用，蛋白印跡法分析證實酵母細胞表達誘餌蛋白。 結(jié)論：mut-PML全長和含環(huán)指/B-BOX的結(jié)構(gòu)域具有轉(zhuǎn)錄因子活性；成功構(gòu)建含coiled-coil結(jié)構(gòu)的PML結(jié)構(gòu)域的酵母誘餌表達載體。 第三部分酵母雙雜交技術(shù)篩選在胞內(nèi)與PML-C結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白 目的：利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與PML-C結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白質(zhì)，為研究野生型PML和其變異體可能的作