NE介導(dǎo)的PML-RARα融合蛋白裂解產(chǎn)物在APL發(fā)生中的分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分NLS-RARα與JTV1蛋白的細(xì)胞內(nèi)共定位實(shí)驗(yàn) 目的：利用間接免疫熒光技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察NLS-RARα和JTV1蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)是否共定位表達(dá)。 方法：構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)載體pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTV1，經(jīng)酶切鑒定后，共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞，利用間接免疫熒光技術(shù)研究它們的表達(dá)是否存在細(xì)胞內(nèi)共定位。 結(jié)果：構(gòu)建的重組表達(dá)載體pCMV-HA-NLS-RARα和pC

2、MV-Myc-JTV1經(jīng)酶切鑒定成功，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。HA-NLS-RARα蛋白用抗HA的一抗和FITC結(jié)合的羊抗鼠IgG標(biāo)記，Myc-JTV1蛋白用抗Myc的一抗和Cy3結(jié)合的羊抗兔IgG標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡下可觀(guān)察到兩種蛋白的共定位表達(dá)。 結(jié)論：成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTV1，在HEK293細(xì)胞表達(dá)后利用間接免疫熒光技術(shù)證實(shí)NLS-RARα和JTV1蛋白在核內(nèi)可共定位

3、表達(dá)，從而進(jìn)一步提示二者在細(xì)胞核內(nèi)存在相互作用的可能。 第二部分早幼粒細(xì)胞白血病基因PML變異蛋白全長(zhǎng)及其結(jié)構(gòu)域誘餌載體的構(gòu)建及鑒定 目的：為研究中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）酶切PML-RARα融合蛋白后產(chǎn)生的早幼粒細(xì)胞白血病基因（PML）的變異蛋白和其中含環(huán)指/B-BOX結(jié)構(gòu)與含coiled-coil結(jié)構(gòu)的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能，構(gòu)建含其變異蛋白全長(zhǎng)及結(jié)構(gòu)域序列的誘餌表達(dá)載體，為進(jìn)一步應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選與之相互作用的蛋白

4、建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：PCR擴(kuò)增mut-PML全長(zhǎng)及其兩個(gè)結(jié)構(gòu)域序列，克隆入誘餌載體pGBKT7中，經(jīng)測(cè)序鑒定后，將誘餌載體轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞AH109中，檢測(cè)誘餌蛋白有無(wú)毒性，滲漏和自激活作用，同時(shí)利用蛋白印跡法分析誘餌蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：成功擴(kuò)增mut-PML全長(zhǎng)及其兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的基因片段，并正確克隆入pGBKT7中。誘餌載體成功轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞AH109中，其中誘餌蛋白BD-mut-PML，BD-PML-B無(wú)毒性，但具有滲

5、漏和自激活作用，誘餌蛋白BD-PML-C無(wú)毒性，滲漏和自激活作用，蛋白印跡法分析證實(shí)酵母細(xì)胞表達(dá)誘餌蛋白。 結(jié)論：mut-PML全長(zhǎng)和含環(huán)指/B-BOX的結(jié)構(gòu)域具有轉(zhuǎn)錄因子活性；成功構(gòu)建含coiled-coil結(jié)構(gòu)的PML結(jié)構(gòu)域的酵母誘餌表達(dá)載體。 第三部分酵母雙雜交技術(shù)篩選在胞內(nèi)與PML-C結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白 目的：利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與PML-C結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白質(zhì)，為研究野生型PML和其變異體可能的作