端粒功能異常誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)及其在腫瘤發(fā)生中的作用與分子機制.pdf

1、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀：
　　 端粒是位于真核細(xì)胞線性染色體末端，由重復(fù)DNA序列和端粒相關(guān)蛋白組成的特殊結(jié)構(gòu)，其主要功能防止染色體末端被化學(xué)修飾或核酶降解，阻止染色體末端被識別為損傷的DNA而誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)和異常的DNA修復(fù)，防止染色體端-端融合、重組和染色體丟失。端粒結(jié)構(gòu)和功能的改變與衰老、遺傳病和腫瘤等密切相關(guān)，因而對調(diào)控端粒結(jié)構(gòu)和功能的分子的研究成為近年來的研究熱點。
　　 端粒結(jié)構(gòu)與功能的維持依賴于端粒的相關(guān)結(jié)合蛋

2、白，其中端粒保護(hù)蛋白的作用尤為重要。端粒保護(hù)蛋白主要由六個核心蛋白組成：Pot1，TRF1，TRF2，TTN2，Rap1和TPP1，其中TRF1、TRF2結(jié)合于端粒雙鏈DNA，Pot1識別并結(jié)合端粒單鏈DNA，而TPP1與Pot1相互作用，通過Tin2與TRF1、TRF2、Rap1連接共同形成端粒保護(hù)蛋白復(fù)合體（Shelterin），在端粒獨特性“T”帽狀結(jié)構(gòu)的形成、維護(hù)端粒DNA免遭損害等方面發(fā)揮重要作用。
　　 TPP1于2

3、004年由3個獨立實驗發(fā)現(xiàn)，在端粒保護(hù)蛋白復(fù)合體的形成過程中起關(guān)鍵作用，并可通過其寡核苷酸結(jié)合域（OB fold）與端粒酶結(jié)合，調(diào)節(jié)端粒酶活性。然而，TPP1在保護(hù)端粒末端不被識別為斷裂的雙鏈DNA（Double StrandBreaks，DSBs），抑制DNA損傷反應(yīng)（DNA Damage Response，DDR）及其啟動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用通路，維持染色體穩(wěn)定性和抑制腫瘤形成等方面的功能，目前尚不清楚。
　　 研究目的：

4、　　 探討抑制TPP1表達(dá)對端粒保護(hù)蛋白Pot1表達(dá)和定位、端粒功能、染色體的穩(wěn)定性、以及腫瘤形成等影響，并探討其可能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
　　 研究內(nèi)容和方法：
　　 1.shTPP1的構(gòu)建：體外構(gòu)建靶向端粒保護(hù)蛋白TPP1的逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的shRNA表達(dá)載體shTPP1，與表達(dá)外源性TPP1的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Wesern Blot檢測shTPP1抑制外源性TPP1蛋白表達(dá)；RT-PCR檢測shTPP1抑制小鼠胚

5、胎成纖維細(xì)胞內(nèi)源性TPP1在轉(zhuǎn)錄水平mRNA的表達(dá)。
　　 2.shTPP1抑制TPP1表達(dá)對Pot1表達(dá)及在端粒上的定位的影響：將shTPP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）后，再轉(zhuǎn)染表達(dá)外源性Potla或Potlb的質(zhì)粒DNA。采用Western Blot檢測外源性Potla和Potlb在抑制TPP1表達(dá)的MEF中的蛋白水平；端粒肽核酸-熒光原位雜交法（PNA-FISH）檢測抑制TPP1表達(dá)后對外源性Potla和Pot

6、lb在端粒上定位的影響。
　　 3.TPP1表達(dá)缺失對端粒末端保護(hù)功能的影響：通過端粒末端脫氧尿嘧啶轉(zhuǎn)移酶法（TdT-FITC）檢測缺失TPP1對染色體末端保護(hù)功能產(chǎn)生的影響。
　　 4.TPP1表達(dá)缺失在誘導(dǎo)端粒DNA損傷反應(yīng)（DDR）中的作用：通過免疫熒光/端粒肽核酸熒光原位雜交法（IF/PNA-FISH）分別檢測ATM+/+和ATM-/-細(xì)胞缺失TPP1表達(dá)后所誘導(dǎo)的端粒DNA損傷反應(yīng)，由此形成的端粒功能障礙誘導(dǎo)損

7、傷灶（TIF），同時通過Western Blot檢測ATM+/+和ATM-/-細(xì)胞中端粒損傷標(biāo)志物γ-H2AX的磷酸化水平。
　　 5.ATM-p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制在TPP1表達(dá)缺失誘導(dǎo)端粒DDR中的作用：采用細(xì)胞生長曲線和BrdU摻入法檢測shTPP1轉(zhuǎn)染后的原代培養(yǎng)細(xì)胞（ATM+/+，p53+/+）的增殖能力，細(xì)胞衰老相關(guān)β-gal染色實驗檢測抑制TPP1表達(dá)后引起的細(xì)胞衰老；Western Blot檢測TPP1表達(dá)缺失后細(xì)胞

8、中磷酸化的p53水平和p21蛋白的表達(dá)，探討ATM-p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抑制TPP1表達(dá)引起端粒DNA損傷反應(yīng)過程中的作用機理。
　　 6.TPP1表達(dá)缺失對喪失ATM活性和p53功能細(xì)胞（ATM-/-細(xì)胞）的染色體穩(wěn)定性的影響：將shTPP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染缺失ATM活性和喪失p53功能的MEF細(xì)胞ATM-/-，通過染色體熒光原位雜交（PNA-FISH）法分析細(xì)胞染色體的畸變與染色體分裂后期橋（anaphase bridge）的形成。

9、
　　 7.染色體不穩(wěn)定性導(dǎo)致細(xì)胞具有致瘤性轉(zhuǎn)化能力和在體內(nèi)形成腫瘤：軟瓊脂糖法（soft agar assay）檢測抑制TPP1表達(dá)后的ATM-/-細(xì)胞（ATM-/--shTPP1）具有致瘤性轉(zhuǎn)化的能力；通過采用重癥免疫缺陷（SCID）小鼠皮下接種缺失TPP1表達(dá)的ATM-/-shTPP1細(xì)胞，觀察抑制TPP1表達(dá)在小鼠體內(nèi)對腫瘤形成的影響。收獲形成的腫瘤組織細(xì)胞，通過PNA-FISH方法分析腫瘤細(xì)胞的染色體的異常狀況。

10、>　　 實驗結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的靶向TPP1的shRNA表達(dá)載體shTPP1；WesternBlot結(jié)果表明shTPP1能明顯抑制外源性。TPP1蛋白的表達(dá)；RT-PCR顯示，shTPP1能有效地降低細(xì)胞內(nèi)源性TPP1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。
　　 2.IF/PNA-FISH方法證實，抑制TPP1表達(dá)后外源性Potla和Potlb不能定位在端粒上，TdT-FITC實驗結(jié)果顯示，缺失TPP1表達(dá)后大約5

11、0％的細(xì)胞出現(xiàn)TdT-FITC陽性，并且陽性信號與端粒疊加在一起。
　　 3.ATM+/+細(xì)胞中抑制TPP1表達(dá)后，端粒損傷標(biāo)志物γ-H2AX和53BP1在染色體端粒形成TIF，但是在ATM-/-細(xì)胞中卻沒有TIF的形成。Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，ATM+/+細(xì)胞中抑制TPP1表達(dá)后，γ-H2AX磷酸化水平明顯增高，而在ATM-/-細(xì)胞中則為陰性。
　　 4.在原代培養(yǎng)的p53+/+細(xì)胞中抑制TPP1表達(dá)后導(dǎo)致細(xì)

12、胞增殖受限，生長緩慢。出現(xiàn)細(xì)胞衰老的特征性標(biāo)志β-gal染色陽性反應(yīng)，并且導(dǎo)致p53磷酸化，p21蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　 5.在ATM-/-MEF細(xì)胞中抑制TPP1表達(dá)后，誘導(dǎo)染色體發(fā)生明顯的畸變，形成分裂后期橋，出現(xiàn)不同類型的異常染色體，包括染色體的不同融合，如p-p融合，q-q融合，p-q融合等，以及出現(xiàn)雙分染色體。
　　 6.Soft agar實驗結(jié)果表明，ATM-/--shTPP1細(xì)胞可以在軟瓊脂糖上生長，并形成細(xì)

13、胞轉(zhuǎn)化克隆。而對照組細(xì)胞ATM-/--vector和ATM+/+-shTPP1都不能形成細(xì)胞轉(zhuǎn)化克隆。
　　 7.具有致瘤性轉(zhuǎn)化能力的ATM-/--shTPP1細(xì)胞在SCID小鼠皮下形成腫瘤，腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)各種類型的異常染色體，與轉(zhuǎn)化細(xì)胞中形成的異常染色體類型一致。
　　 結(jié)論：
　　 1.體外成功構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的shTPP1表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染MEF細(xì)胞后能夠有效地抑制TPP1的表達(dá)。
　　 2.TPP

14、1是Potla或Potlb定位于端粒所必需的，缺失TPP1表達(dá)后引起端粒末端降解而失去保護(hù)，導(dǎo)致端粒功能異常。
　　 3.抑制TPP1誘發(fā)端粒發(fā)生ATM依賴的DNA損傷反應(yīng)，誘導(dǎo)p53依賴的細(xì)胞衰老。
　　 4.在失去ATM與p53的細(xì)胞中抑制TPP1表達(dá)，誘導(dǎo)DDR導(dǎo)致細(xì)胞染色體畸變，形成分裂后期橋，標(biāo)志著缺失TPP1表達(dá)誘導(dǎo)的端粒功能異常導(dǎo)致了染色體異常與基因組不穩(wěn)定。
　　 5.ATM-/--shTPP1細(xì)

15、胞染色體功能異常，導(dǎo)致細(xì)胞具有致瘤性轉(zhuǎn)化能力，并能在SCID小鼠體內(nèi)形成腫瘤。
　　 生物學(xué)意義：
　　 1.shTPP1是一種在細(xì)胞內(nèi)研究TPP1基因失去功能的有用工具。
　　 2.抑制TPP1表達(dá)誘導(dǎo)的端粒功能異常，導(dǎo)致端粒發(fā)生ATM依賴的DNA損傷反應(yīng)，啟動p53介導(dǎo)的細(xì)胞衰老機制。
　　 3.失去TPP1將導(dǎo)致端粒功能異常，與喪失ATM-p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同作用，促進(jìn)端粒功能異常導(dǎo)致的染色體不穩(wěn)