山羊瘤胃原蟲與細菌吞噬關(guān)系和微生物AA變化機制的研究.pdf

1、瘤胃微生物蛋白質(zhì)是反芻動物小腸氨基酸(AA)的重要組分。微生物的任何變化，如微生物的區(qū)系、AA-N比例、AA組成等的變化都將影響十二指腸AA的供給。在過去的研究和生產(chǎn)中一直認為瘤胃微生物AA是恒定的。然而1992年Clark等綜合比較眾多研究者的研究結(jié)果提出了瘤胃微生物AA是可變化的觀點，此后至今，由于其對宿主不可或缺的重要性而使得微生物AA變化與否的論題一直為本領域研究與爭論的焦點。為此，本課題結(jié)合加vitro與in vivo法，并引

2、入熒光標記細菌技術(shù)以及SSCP、克隆測序等分子生物學技術(shù)，系統(tǒng)地探討微生物蛋白質(zhì)AA的變化規(guī)律及其機制，試驗共分九個部分進行。 試驗1熒光標記瘤胃細菌方法的建立和原蟲吞噬細菌速率的研究 以4只裝有永久性瘤胃瘺管的徐淮山羊提供的瘤胃液制備熒光標記瘤胃細菌，用于瘤胃原蟲的攝食實驗，研究山羊瘤胃原蟲吞噬細菌的速率。試驗設置清洗原蟲祛除瘤胃自由細菌的熒光全標組(WFLB)及未清洗原蟲保留瘤胃自由細菌的熒光標記組(FLB)。結(jié)果表

3、明：WFLB組、FLB組吞噬速率分別為：398.40 cells/(cell h)、230.40 cells/(cell h)，換算為細菌N為：2.15 pg N/(cell h)、1.24 pg N/(cell h)；每天每頭山羊瘤胃內(nèi)蛋白微循環(huán)中細菌N循環(huán)量WFLB組、FLB組分別估計為：103.20 mg N/(d頭)、59.50 mg N/(d頭)，或者細菌蛋白循環(huán)量分別為0.645 g/(d頭)和0.372 g/(d頭)；結(jié)果

4、同時表明，熒光標記技術(shù)可以應用于瘤胃原蟲對細菌吞噬速率的研究。 試驗2日糧精粗比對山羊瘤胃內(nèi)微生物蛋白質(zhì)微循環(huán)影晌的研究 本試驗以4只裝有瘤胃瘺管的山羊，研究不同精粗比日糧對山羊瘤胃微生態(tài)中原蟲和細菌區(qū)系以及微生物蛋白微循環(huán)的影響規(guī)律。試驗設置精(玉米-豆粕)：粗(稻草)分別為10：90、30：70、50：50、70：30的四種比例日糧(A、B、C、D)，采用4×4拉丁方設計進行動物試驗，并結(jié)合熒光標記瘤胃細菌技術(shù)測定瘤

5、胃原蟲對細菌的吞噬速率。 試驗3精粗比對瘤胃發(fā)酵、原蟲種群結(jié)構(gòu)及吞噬速率的影響 在試驗2的基礎上，進一步研究在不同精粗比例配合日糧條件下山羊瘤胃發(fā)酵、原蟲種群結(jié)構(gòu)以及吞噬速率的變化規(guī)律。結(jié)果表明：日糧精粗比對瘤胃發(fā)酵有影響。以30：70組微生物活力較強、NDF降解率較高、瘤胃pH值也相對波動較?。痪直葘α鑫冈x結(jié)構(gòu)也有影響。50：50、70：30日糧組內(nèi)毛蟲和等毛蟲的比例顯著高于10：90、30：70組；而雙毛蟲和頭毛

6、蟲則相反。內(nèi)毛蟲與雙毛蟲和頭毛蟲的吞噬速率分別為361.90、606.30和607.50 cells/(cell h)，內(nèi)毛蟲的吞噬速率顯著低于雙毛蟲和頭毛蟲(P=0.000)，表明不同種屬原蟲吞噬細菌速率間有顯著差異，但隨日糧精粗比變化的規(guī)律基本一致。回歸分析表明吞噬速率與日糧結(jié)構(gòu)間呈三次方的曲線關(guān)系(Y=-724.53X+563.15x2.124.666X3+646.833，RZ=0.97864)。另外，多元回歸分析表明吞噬速率與微

7、生物細胞密度有線性關(guān)系(R2=0.839)。方程為：Y=445.514.3.078X1+1.864X2(Y為吞噬速率；X1為細菌密度；X2為原蟲密度)。 試驗4碳水化合物結(jié)構(gòu)對瘤胃發(fā)酵和微生物群體結(jié)構(gòu)的影響 以3只瘺管山羊作為瘤胃液供體，用體外法研究底物碳水化合物結(jié)構(gòu)對瘤胃發(fā)酵及微生物群體特征的影響。底物可溶性淀粉/纖維素比例為：100：0、70：30、50：50、30：70、0：100。結(jié)果表明：30：70組微生物產(chǎn)量

8、和纖維降解率最高，發(fā)酵狀態(tài)最佳；微生物蛋白產(chǎn)量與淀粉/纖維有三次方的曲線關(guān)系，細菌蛋白：Y=0.2410+0.0855X-0.0371X2+0.0029X3(R=0.7397)；原蟲蛋白：Y=0.2276+0.0853X-0.0380X2+0.0030X3(R=0.7370)。各組分別在8、16、24、24和24 h出現(xiàn)最大微生物產(chǎn)量(P<0.01)。另外，微生物AA-N比例在各組間也有顯著差異(P<0.05)。微生物區(qū)系原蟲與細菌的比

9、例總體上隨淀粉水平下降呈先上升后降低，以50：50組最高；而且PCR-SSCP圖譜反映了區(qū)系內(nèi)部類群因底物的改變而改變。原蟲分類計數(shù)結(jié)果表明隨淀粉水平的下降，內(nèi)毛蟲與等毛蟲的比例下降，而雙毛屬與頭毛亞科原蟲的比例增加，與SSCP的結(jié)果一致地表明其內(nèi)部類群的改變。對提取DNA的質(zhì)、量的檢測表明：微生物分離平均獲得率為53.29％；細菌DNA的提取率(45.40％)顯著低于原蟲(56.10％)(P<0.05)；微生物分離后DNA提取率為26

10、.13％；所提取的基因組DNA大小在20 kb以上，適合于后續(xù)研究的分子操作。綜合以上試驗結(jié)果可認為底物的變化引起了微生物發(fā)酵和其群系特征的變化，結(jié)果還證實PCR-SSCP適合于瘤胃微生物混合群體多樣性研究，同時也驗證了ITS1區(qū)段是研究瘤胃原蟲的良好素材，從而基本確立了本課題瘤胃微生物群體研究的方法體系。 試驗5不同分子形式氮源對瘤胃微生物蛋白產(chǎn)量和類群多樣性的影響 本試驗的主要目的是研究不同分子形式氮源在人工瘤胃體外

11、培養(yǎng)條件下對瘤胃發(fā)酵、微生物蛋白合成和類群多樣性的影響。以3只瘺管山羊為瘤胃液供體，底物設計為：氯化銨、寡肽混合物(<3，000 Da)、小肽混合物(<500 Da)、游離氨基酸混合物。 試驗6特定AA缺省對體外培養(yǎng)瘤胃微生物生長限制性的研究 本試驗采用底物移除法研究特定氨基酸在人工瘤胃體外培養(yǎng)條件下對瘤胃微生物生長及其發(fā)酵特征的影響。以3只瘺管山羊作為瘤胃液供體，底物為：全量必需氨基酸組(A)，組氨酸(B)、賴氨酸(C

12、)、蛋氨酸(D)和支鏈氨基酸(E)的缺省組。結(jié)果表明：培養(yǎng)液pH值在5.90-6.80之間變化，均值以E組最高為6.54；培養(yǎng)液氨氮濃度變動范圍為10.99-30.51 mg/100ml，均值以A組最高為17.85 mg/100 Inl：底物對微生物生長的限制程度不同。以支鏈氨基酸缺省對微生物蛋白合成的限制最大，其細菌與原蟲及其微生物蛋白的產(chǎn)量皆最低(0.1389、0.1772和0.3 161 mg/ml) (P<0.01)，相對于A組

13、微生物蛋白下降了44.52％。底物對細菌和原蟲影響不同。原蟲與細菌比值以C組最低(89.12％)，E組最高(127.60％)(P<0.01)。同時底物還引起了微生物AA-N比例的變化(P<0.01)，以A組最低(16.89)，E組最高(18.76)。另外遺傳指紋分析提示微生物區(qū)系內(nèi)部類群也因底物而發(fā)生了變化。綜合以上試驗結(jié)果可認為特定氨基酸對微生物生長及微生物發(fā)酵都有一定的影響。 試驗7蛋白質(zhì)補充料對體外培養(yǎng)瘤胃微生物區(qū)系和發(fā)酵

14、的影響 本試驗以不同蛋白質(zhì)補充料為底物進行體外培養(yǎng)，主要探討蛋白質(zhì)補充料對瘤胃微生物發(fā)酵和區(qū)系特征的影響。試驗采用3只瘺管山羊作為瘤胃液供體，底物為：A(羽毛粉)、B(玉米蛋白粉)、C(豆粕)和D(魚粉)。 試驗8以4只瘺管山羊作為試驗動物，采用4×4拉丁方設計進行試驗。研究由羽毛粉(A)、玉米蛋白粉(B)、豆粕(C)和魚粉(D)等不同蛋白質(zhì)飼料配合的混合日糧對瘤胃發(fā)酵、微生物群體結(jié)構(gòu)、微生物蛋白(MCP)產(chǎn)量及其AA組

15、成模式的影響規(guī)律。在第一期正試期開始時分別從四只羊瘤胃中采集瘤胃液，用于相應日糧作為培養(yǎng)底物的預先體外培養(yǎng)試驗，以確保復雜與昂貴的體內(nèi)試驗的有效性和必要性。結(jié)果表明，由不同蛋白補充料所配制混合飼料底物對瘤胃發(fā)酵、微生物類群結(jié)構(gòu)及AA-N影響與單純的蛋白補充料相比，在底物樣本間差異程度上雖然有所降低，但影響規(guī)律影響基本一致，并且微生物類群結(jié)構(gòu)及AA-N仍有明顯或顯著變化，表明進一步開展體內(nèi)試驗是必要和有意義的。 試驗9繼而開展的1

16、04天的4x4拉丁方體內(nèi)試驗結(jié)果表明：瘤胃液pH值在5.60-6.80之間變化，均值以A和C組較高，B和D組較低(P<0.05)，A和C、B和D的pH均值雖相近，但隨時間的動態(tài)變化模式相差較大；氨氮濃度變動范圍為6.77-21.67 mg/100ml，均值以A組最低為11.08 mg/100ml，C組最高為15.04 mg/100ml，各組隨時間動態(tài)變化模式也有所不同；日糧蛋白顯著影響MCP產(chǎn)量，以C、D組微生物蛋白較高，A、B組較低(

17、P<0.05)；雖然C、D組微生物蛋白相當，但C組細菌蛋白產(chǎn)量卻顯著高于D組(P<0.05)。原蟲與細菌區(qū)系比例在組間差異顯著，豆粕組(81.27％)顯著低于其他三組(P<0.05)。進一步克隆測序分析表明細菌中的類R．flavefaciens、R．bromii、Roseburia faecalis等8群系在組間差異顯著；原蟲中除Diplodinium外其他4類群都有顯著差異。微生物的AA-N比例在各組間也有顯著差異，并以C組最低，D組