雄激素受體全外顯子測序在雄激素不敏感綜合癥患者中的應(yīng)用和意義.pdf

1、雄激素不敏感綜合癥由于雄激素受體的結(jié)構(gòu)和功能的改變，導(dǎo)致結(jié)合雄激素的作用減弱。雄激素受體功能損傷程度越大，其女性化程度越強(qiáng)。以前又被稱為睪丸女性化。雄激素不敏感綜合癥是X連鎖隱形遺傳病，突變可通過無癥狀的雜合子女性代代相傳。雄激素和雄激素受體對男性的表型和精子的產(chǎn)生有非常重要的作用。雄激素受體(Androgen receptor，AR)，它是一種轉(zhuǎn)錄因子。其結(jié)構(gòu)和糖皮質(zhì)激素，雌激素和孕激素等受體比較相似。正常的AR蛋白可以結(jié)合雄激素，通

2、過轉(zhuǎn)錄，達(dá)到生物學(xué)效應(yīng)。本研究對34例男性不育癥患者進(jìn)行雄激素受體(AR)的全外顯子測序，尋找34例病人中AR基因突變位點(diǎn)，結(jié)合性激素測定和精液常規(guī)檢查，研究導(dǎo)致雄激素不敏感綜合癥的基因突變位點(diǎn)。分析突變位點(diǎn)對AR蛋白序列及結(jié)構(gòu)的可能影響。
　　目的：對34例男性不育癥患者的AR的全外顯子測序，以檢查雄激素受體基因是否發(fā)生突變。結(jié)合患者的性激素測定和精液常規(guī)檢查，臨床表現(xiàn)，探討其分子發(fā)病機(jī)制和伴隨癥狀，為雄激素不敏感患者的診斷和臨

3、床治療提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.利用常規(guī)染色體和G顯帶，每個患者鏡下計數(shù)30個分裂相，染色體核型的分析。
　　2.采用化學(xué)發(fā)光法(Beckman DXI800)檢測血清卵泡刺激素(Follicle-stimulatinghormone，F(xiàn)SH)，黃體生成素(Luteinzing hormone，LH)，泌乳素(prolactin，PRL)，雌二醇E2(Estrogen，E2)，睪酮(Testosterone，

4、T)。
　　3.利用計算機(jī)輔助精液分析檢測儀，按照WHO精液分析標(biāo)準(zhǔn)，做精液常規(guī)檢測;
　　4.利用DNA提取試劑盒，從34例患者的外周血中提取DNA，利用人雄激素受體基因突變的試劑盒，一套用于雄激素受體擴(kuò)增和測序的特異性引物，采用PCR擴(kuò)增技術(shù)和DNA測序技術(shù)，分別擴(kuò)增每個患者的雄激素受體8個外顯子序列，并進(jìn)行DNA測序，再與Genbank中的AR標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較，找出突變位點(diǎn)。AR蛋白結(jié)構(gòu)分析根據(jù)AR基因標(biāo)準(zhǔn)序列(NP_

5、0000352)和PUBMEDGenebank中的mRNA標(biāo)準(zhǔn)序列找出氨基酸的變化，然后通過SOPMA預(yù)測AR的二級結(jié)構(gòu)，分析其二級結(jié)構(gòu)的改變。
　　5.利用統(tǒng)計學(xué)SPSS分析，結(jié)果以P表示。性激素檢查還運(yùn)用了graphpad6.0軟件進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.患者染色體核型分析均為是46，XY。
　　2.本實驗中AR基因突變者和AR基因未突變者相比較。性激素測定FSH，LH，E2，T，PRL水平之間無統(tǒng)計

6、學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.AR基因突變和AR基因未突變的精液體積，精子總量，精子濃度，形態(tài)學(xué)，a+b運(yùn)動學(xué)水平之間沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.利用AR全外顯子測序來輔助診斷雄激素不敏感綜合癥，34例雄激素不敏感綜合癥中有5例病人的AR的基因序列發(fā)生突變，而且5例病人的突變都存在第一外顯子中。分別是:①第一外顯子長片段第一段與已知序列相比有突變，在526位堿基處存在一個C＞A的點(diǎn)突變，并且第一外顯子31位

7、賴氨酸代替谷氨酸(E31K)，使α螺旋比重減少，氨基酸無規(guī)則卷曲增加，β轉(zhuǎn)角減少，延伸鏈增加。②第一外顯子DNA序列存在突變，AR第一外顯子存在1284位AGTTTGCTG插入突變以及總外顯子1288位A＞T突變，第一外顯子57位有三個氨基酸序列插入，分別是絲氨酸-亮氨酸-亮氨酸，并且58位亮氨酸代替谷氨酰胺(Q58L)，使一個α螺旋的比重增加，無規(guī)則卷曲減少，β轉(zhuǎn)角減少，延伸鏈減少。③雄激素受體第一外顯子存在突變，外顯子1385G＞T

8、突變，并且89位組氨酸代替谷氨酰胺(Q89H)，但是AR的二級結(jié)構(gòu)卻沒有變化。④患者第一個外顯子(E1-A)端，在1278位堿基處存在T＞A的突變，并且56位谷氨酰胺代替亮氨酸(L56Q);在1326位堿基處存在A＞G的突變，并且72位精氨酸代替谷氨酰胺(Q72R)，突變處α螺旋比重發(fā)生減少，氨基酸無規(guī)則卷曲增加，β轉(zhuǎn)角減少，延伸鏈減少。⑤在第一外顯子第三段存在3個GCG缺失多態(tài)性突變，并且TAD區(qū)域的第726位堿基存在T＞G的點(diǎn)突變，