PD--L1單鏈抗體的篩選、抗體偶聯(lián)藥物的制備以及抗腫瘤活性的研究.pdf

1、目的：
　　本論文實(shí)驗完成了PD-L1細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的優(yōu)化，進(jìn)一步利用噬菌體展示技術(shù)成功篩選出抗PD-L1的單鏈抗體可變區(qū)片段(scFv)。選擇高親和力的克隆并在細(xì)菌宿主中成功表達(dá)。純化的蛋白質(zhì)被加工用于抗體偶聯(lián)藥物(ADC)的研究和全抗體生產(chǎn)。針對不同癌細(xì)胞系對優(yōu)化的scFv-PD-L1藥物綴合物活性及其細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸進(jìn)行了研究。全長抗體基因轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO細(xì)胞并且在無血清培養(yǎng)基中成功表達(dá)，并(將)得到的全長抗體檢測其在PD-L1陽性細(xì)胞

2、中的表面結(jié)合親和力。這些重組分子(將)可以用于抗PD-L1癌癥治療和生物治療劑的深入研究。
　　方法：
　　PD-L1基因在國家生物技術(shù)信息中心和歐洲生物信息學(xué)研究所數(shù)據(jù)庫是使用人類分類學(xué)鑒定號9606，在NCBI中的參考序列是NM_014143.2和NM_014143.3，PD-L1胞外結(jié)構(gòu)域(PDL1-ECD)的檢索號是Q9NZQ7。編碼PDL1-ECD的基因片段通過特定引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物兩端加入EcoR1和XhoI限制

3、酶切位點(diǎn)以便于進(jìn)行酶切。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T克隆載體上形成重組克隆載體pMD18-T/PDL1-ECD，然后(將)限制性酶切產(chǎn)物連接到pET30(+)載體中，并(將)重組載體pET30(+)/PDL1-ECD克隆到大腸桿菌BL21(DE3)中，表達(dá)重組蛋白。陽性轉(zhuǎn)化菌BL21(DE3)生長至對數(shù)生長期(OD600=0.4-0.6)時，加入終濃度為1mM的異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，并分別在37℃，30

4、℃，28℃，和16℃條件下培養(yǎng)5h后收集。收集到的細(xì)菌通過裂解和超聲，并經(jīng)Ni-NTA柱親和層析純化，PBS緩沖液透析。得到的PD-L1重組蛋白通過噬菌體展示技術(shù)篩選獲得scFv-PD-L1抗體。
　　M13KO7輔助噬菌體(1.47×1012)轉(zhuǎn)染大腸桿菌TG1，并通過在37℃的2YT培養(yǎng)基中孵育16h進(jìn)一步富集，用20％PEG/2.5M NaCl溶液進(jìn)行濃縮，最后離心收集。Ni-NTA樹脂經(jīng)0.5M NaCl洗滌后加入300μ

5、g/ml的PD-L1蛋白，使其與樹脂結(jié)合。加入5％BSA封閉1h，隨后在封閉緩沖液中加入擴(kuò)增的噬菌體孵育2h，然后用TBST洗滌5次。特異結(jié)合的噬菌體依次用洗脫緩沖液(200mM咪唑，0.5M NaCl，0.1M PBS)和0.2M甘氨酸-HCl(pH1.7)處理洗脫。洗脫液用Tris-HCl(pH9.0)調(diào)節(jié)pH值并進(jìn)行過濾。洗脫的噬菌體轉(zhuǎn)染進(jìn)TG1進(jìn)行選擇，并鋪板于含100μg/ml氨芐青霉素的2YT瓊脂平板上。(將)陽性克隆接種到

6、液體培養(yǎng)基中并在37℃孵育，隨后加入濃度為1010的輔助噬菌體進(jìn)行侵染。培養(yǎng)16h后收集菌液，PD-L1陽性的scFv克隆可用PEG/NaCl溶液濃縮。重復(fù)該過程三次以分離高親和力的克隆。選取300個陽性克隆用于序列分析和補(bǔ)體確定區(qū)域。挑取陽性克隆，進(jìn)一步用大腸桿菌宿主機(jī)制表達(dá)，并通過Ni-NTA樹脂純化。用咪唑洗脫蛋白質(zhì)并用PBS進(jìn)行透析。洗脫的scFv-PD-L1蛋白的結(jié)合親和力可用ELISA，Western印跡和免疫熒光技術(shù)分析測

7、定。
　　利用高親和力的scFv-PD-L1表達(dá)蛋白來制備抗體偶聯(lián)藥物?？贵w偶聯(lián)藥物一般包含三種基本組分:抗體、接頭和細(xì)胞毒性藥物。我們使用scFv-PD-L1表達(dá)蛋白所攜帶的重鏈和輕鏈可變區(qū)作為抗體組分，SMCC作為接頭和DM1細(xì)胞毒性藥物。(將)20mM SMCC接頭和10mM DM1藥物分別溶于DMSO中。(將)20倍SMCC和10倍DM1混合并在20℃溫育，然后加入scFv-PD-L1蛋白(1mg/ml)?；旌衔镫S后在37

8、℃溫育20h。(將)最終的混合物過濾并倒入Sephadex G-25柱中，用PBS以0.5ml/min的流速洗脫。用Shimadzu-UV-2600分光光度儀分析收集的濾液在250nm和280nm波長處的吸光度。
　　噬菌體抗體scFv-PD-L1隨后可用于構(gòu)建全長抗體，重鏈和輕鏈可變區(qū)可作為擴(kuò)增模板。設(shè)計引物用于擴(kuò)增和連接可變區(qū)片段和信號肽。(將)EcoRI和NheI限制性酶切位點(diǎn)分別添加到重鏈片段和信號肽兩端，(將)Bsiw

9、I限制性酶切位點(diǎn)添加到輕鏈中以助于構(gòu)建重組子。這些片段通過PCR擴(kuò)增并連接起來，然后(將)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行純化。(將)純化產(chǎn)物用酶消化以產(chǎn)生切口位點(diǎn)。(將)片段插入pMH3-kH/kL載體以形成嵌合體。(將)重組載體轉(zhuǎn)移至細(xì)菌細(xì)胞，通過測序，PCR鑒定和酶消化(確)認(rèn)重組子。提取質(zhì)粒并用Lipofectamine2000(將)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。使用G418抗生素篩選陽性克隆。(將)陽性細(xì)胞在96孔板中進(jìn)行單克隆化

10、以得到單細(xì)胞陽性克隆。隨后擴(kuò)大培養(yǎng)至24，12和6孔板。選擇高滴度克隆轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中以獲得最大抗體表達(dá)量?？贵w結(jié)合親和力是使用培養(yǎng)上清液用ELISA測定的。表達(dá)的抗體通過Protein A純化，并計算其與PD-L1陽性細(xì)胞的結(jié)合親和力。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗結(jié)果表明，我們構(gòu)建的pET30(+)/PDL1-ECD系統(tǒng)能有效地產(chǎn)生38.1kD的重組蛋白。原核表達(dá)系統(tǒng)為表達(dá)PD-L1細(xì)胞外蛋白提供了一種簡便的方法，有助于PD-

11、1/PD-L1結(jié)合抑制作用的研究和有價值的藥物及抗體的制備。蛋白印跡分析結(jié)果表明重組表達(dá)的PD-L1-ECD能被人抗-PD-L1IgG識別。結(jié)果說明重組純化蛋白具有生物活性構(gòu)象，并保持了有效的抗原性，可以進(jìn)一步用于有效的抗體和治療藥物的制備。
　　噬菌體展示技術(shù)結(jié)果顯示在兩次重復(fù)的篩選過程中產(chǎn)率都得到提高，分別為4.0×103和3.76×104(富集倍數(shù)分別為22.56和1225.27)。有8個不同的克隆被發(fā)現(xiàn)有精(確)的基因組成

12、，其中4個具有相同的基因組成。我們從其中選擇了一個和其余四個進(jìn)行重組蛋白表達(dá)。我們成功構(gòu)建并表達(dá)了三種最佳高結(jié)合親和力的克隆，并進(jìn)行免疫熒光，ELISA和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析以(確)認(rèn)其生物活性。
　　構(gòu)建的抗體偶聯(lián)藥物通過SDS-PAGE電泳，分光光度法和免疫熒光技術(shù)進(jìn)行鑒定。與未綴合藥物的蛋白相比，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示抗體偶聯(lián)藥物條帶的位(置)略微增加。偶聯(lián)綴合物使用分光光度法顯示有兩種不同峰值的吸光度。其中一個單峰顯示

13、綴合的藥物，而另一個峰顯示非共軛的實(shí)體。未綴合物的吸光度位于兩個不同的位(置)，以區(qū)分未綴合的藥物與綴合的藥物。我們還分析了抗體偶聯(lián)藥物的胞內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制。我們以不同的時間間隔(將)scFv-PD-L1抗體偶聯(lián)藥物與PD-L1陽性癌細(xì)胞系(A549)共同孵育，并發(fā)現(xiàn)在孵育2h時，ADC分子都能聚集在A549細(xì)胞表面，這在細(xì)胞內(nèi)研究中可用作有效溫育的時間。3h后A549細(xì)胞表面結(jié)合信號增加，可能表明內(nèi)化藥物運(yùn)輸回細(xì)胞表面。
　　抗PD-

14、L1全長抗體成的功表達(dá)及通過ELISA和細(xì)胞表面結(jié)合相互作用檢測了其生物活性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染和抗體表達(dá)均在無血清培養(yǎng)基進(jìn)行中。單鏈片段由重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成。這些可變區(qū)通過接頭連接，可以為重組全長抗體表達(dá)提供多樣化來源。我們構(gòu)建了全長抗體，并成功轉(zhuǎn)移到中國倉鼠卵巢(CHO)哺乳動物宿主中進(jìn)行全長抗體表達(dá)。(將)表達(dá)的抗體作用于PD-L1陽性癌細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合親和力的測定。陽性信號顯示表達(dá)抗體具有有效性。
　　結(jié)論：
　　我們在實(shí)驗室

15、的小規(guī)模的表達(dá)純化中得到了純度更高，有生物活性成分的重組蛋白。使用大腸桿菌宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)為表達(dá)重組PD-L1蛋白提供了簡單方法，研究重組PD-L1蛋白可用于產(chǎn)生針對癌細(xì)胞的抗體和ADC。另外我們研究出一種從人類合成文庫中篩選出抗PD-L1的scFv的新方法，即應(yīng)用高滴度的噬菌體富集技術(shù)和構(gòu)建表達(dá)scFv的原核重組載體系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究抗體生產(chǎn)和載藥藥物載體工(具奠)定了綜合基礎(chǔ)。獲得的陽性表達(dá)的scFv能在癌癥治療中識別PD-L1抗

16、原有很好的應(yīng)用前景，并且可以消除其它多克隆抗體在組織和細(xì)胞中造成的不良影響。
　　本研究制備的新型藥物可以用作位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的有效工(具)，可以在體外大范圍地針對PD-L1陽性癌細(xì)胞的特異性進(jìn)行檢測，并且可以用于進(jìn)一步的體內(nèi)測試和臨床開發(fā)。另外，構(gòu)建表達(dá)的全長抗體保留了對PD-L1表面抗原的高親和力，創(chuàng)新性在于沒有其他關(guān)于借助CHO細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生抗PD-L1蛋白的文獻(xiàn)研究。該抗體通過阻斷PD-L1/PD-1相互作用和抑制腫瘤的作用，