基于防御素的巨胞飲介導重組融合蛋白以及雙靶向單鏈抗體重組融合蛋白的制備和抗腫瘤活性研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述：
　　第一部分 基于防御素HBD2的巨胞飲介導融合蛋白的制備及其抗腫瘤活性和作用機制研究
　　研究目的:據(jù)報道，K-Ras基因突變的胰腺癌細胞表現(xiàn)出明顯增強的巨胞飲過程(elevated level of macropinocytosis)，來滿足自身獨特的營養(yǎng)需求，這一發(fā)現(xiàn)為針對巨胞飲過程的靶向抗腫瘤藥物設(shè)計方案提供了理論依據(jù)。本研究利用白蛋白作為巨胞飲介導的靶向治療藥物輸送載體，構(gòu)建了一種

2、白蛋白整合的β防御素(DF-HSA)，由“效應”分子人β防御素2(HBD2，DF)和巨胞飲導向性的人血清白蛋白(HSA)兩部分組成，研究其對K-Ras突變胰腺癌的抗腫瘤活性。
　　研究方法:選擇胰腺癌MIA PaCa-2和BxPC-3細胞研究DF-HSA的巨胞飲攝取量和細胞毒性;并以HSA和HBD2分子作為實驗對照，研究DF-HSA的體外抗腫瘤活性。建立人胰腺癌MIA PaCa-2裸鼠移植瘤模型進行DF-HSA體內(nèi)靶向分布的考察和

3、初步的藥效評價。應用人類基因表達譜芯片檢測HBD2和DF-HSA作用于MIA PaCa-2細胞后的基因表達差異。
　　研究結(jié)果:K-Ras突變的胰腺癌MIAPaCa-2細胞中，DF-HSA通過巨胞飲介導的內(nèi)化過程進入細胞;MIA PaCa-2細胞中巨胞飲的強度與K-Ras野生型的BxPC-3細胞相比明顯增高;在細胞毒性方面，融合蛋白DF-HSA明顯強于HSA和游離的防御素HBD2; DF-HSA誘導MIA PaCa-2細胞線粒體損

4、傷，并激活腫瘤細胞線粒體凋亡途徑。值得注意的是，DF-HSA對K-Ras突變的MIA PaCa-2胰腺癌裸鼠移植瘤有顯著治療效果，30mg/kg的DF-HSA抑瘤率達到81％且耐受良好?；铙w呈像結(jié)果顯示，DF-HSA在體內(nèi)能特異性富集并長時間滯留在腫瘤部位。經(jīng)DF-HSA處理的MIA PaCa-2細胞基因表達譜變化明顯，這些基因功能涉及基因表達和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、細胞代謝和細胞凋亡等多個方而。
　　研究結(jié)論:β防御素與白蛋白整合的融合蛋

5、白DF-HSA，可以通過巨胞飲介導的過程大量進入K-Ras突變的胰腺癌細胞，對胰腺癌裸鼠異種移植瘤顯示特異性分布，并有良好的治療效果。結(jié)果表明，DF-HSA在巨胞飲介導的腫瘤靶向治療方面是一個是有應用前景的分子。
　　第二部分 基于防御素HBD1的雙單鏈抗體融合蛋白的制備
　　HBD1作為人體先天性免疫的重要組成成分，不僅具有廣譜的抗微生物活性外，還具有殺傷腫瘤細胞和免疫調(diào)理的作用，而且不易產(chǎn)生耐藥性。大量的研究顯示，hbd

6、1在體內(nèi)作為一種抑癌基因存在，而HBD1不僅可以選擇性地裂解殺傷腫瘤細胞，還能發(fā)揮抗腫瘤免疫的作用。所以HBD1具有良好的抗腫瘤潛能和應用前景。由于涉及腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和血管生成等過程，基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)被認為是一類理想的靶標。明膠酶屬于基質(zhì)金屬蛋白酶的一種，包括MMP-2和MMP-9兩種組分，其能夠破壞基底膜及細胞外基質(zhì)的完整性，參與腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，并且在腫瘤血管發(fā)生和新

7、生血管的形成過程中都起到重要作用。據(jù)報道，明膠酶在侵襲和轉(zhuǎn)移性腫瘤如在胰腺癌中大量表達。本研究的目的是選擇人β防御素1(HBD1)作為抗腫瘤活性分子，通過基因工程手段構(gòu)建了以LDP為支架具有靶向明膠酶(MMP2/9)的防御素HBD1融合蛋白β1-dFv-LDP，利用抗體靶向結(jié)合腫瘤細胞表面及微環(huán)境MMP2/9的特性，將HBD1定向運輸至腫瘤部位，使其發(fā)揮特異性腫瘤細胞毒作用和抗腫瘤免疫作用，同時抑制MMP2/9的表達或者活性，為胰腺癌靶

8、向治療藥物的研究提供借鑒與參考。本研究中我們通過分子生物學方法構(gòu)建了重組表達載體PET-30a/β1-dFv-LDP，通過大腸桿菌表達體系誘導表達，產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在，經(jīng)純化復性后每升發(fā)酵液可以獲得20mgβ1-dFv-LDP融合蛋白，該融合蛋白對明膠酶抗原具有與dFv-LDP相似的的親和活性。
　　第三部分 靶向EGFR/明膠酶的雙特異性單鏈抗體融合蛋白Fv(E)-LDP-Fv(M)的制備
　　多靶向治療策略一直是

9、抗腫瘤研究中最熱門的話題之一。其中雙特異性抗體能同時高效結(jié)合兩種抗原表位，是多重調(diào)控功能的聯(lián)合靶向抗腫瘤的有效策略之一。表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）屬于跨膜受體酪氨酸激酶(ErbB)家族成員;EGFR在多種腫瘤細胞表面都異常表達，與人類癌癥關(guān)系密切，被認為是研究腫瘤治療的一個重要分子靶點。此外，腫瘤基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)也在腫瘤進展和侵襲轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，其中明

10、膠酶（MMP-2和MMP-9）在多種腫瘤組織中異常表達，使其成為另一個理想的靶向治療靶點。力達霉素(Lidamycin，LDM)是一種具有高效抗腫瘤活性的大分子肽類抗腫瘤抗生素，由輔基蛋白(LDP)和烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(AE)兩部分組成，發(fā)色團是力達霉素分子的活性部分?；贓GFR和MMP2/9在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，本研究的目的是制備一種同時靶向EGFR和明膠酶的并具有藥物導向的雙特異性單鏈抗體融合蛋白Fv(E)-LDP-Fv

11、(M)，該融合蛋白由三部分組成:兩個分別靶向EGFR和MMP2/9的scFv作為導向分子，力達霉素作為“彈頭”藥物，并對其體內(nèi)外抗腫瘤活性進行檢測。表達該重組蛋白的質(zhì)粒pET30a(+)/Fv(E)-LDP-Fv(M)經(jīng)過序列測定后，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌Transetta(DE3)中，進行誘導表達，產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在，目的蛋白經(jīng)純化、復性后，每升發(fā)酵液可以獲得0.5 mg有活性的Fv(E)-LDP-Fv(M)融合蛋白，該融合蛋白對EG