抗人整合素β3亞基單克隆抗體及其單鏈抗體的制備和抗腫瘤活性的研究.pdf

1、【目的】制備抗人整合素β3亞基的單克隆抗體，研究其對(duì)腫瘤治療的作用。并在此單抗的基礎(chǔ)上，為降低鼠源性單抗的異種抗原性和高分子量，應(yīng)用基因工程抗體技術(shù)制備抗人整合素β3亞基單鏈抗體(ScFv)，為進(jìn)一步研究整合素β3抗體在腫瘤診斷和治療中的作用奠定基礎(chǔ)。 【方法】從人白細(xì)胞中提取總RNA，用人B3胞膜外基因的引物，以RT—PCR的方法擴(kuò)增人B3胞膜外基因，將其克隆至原核表達(dá)載體pQE30中，獲得含B3胞膜外基因的高效表達(dá)載體pQE

2、30-β3，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得B3蛋白。將此蛋白免疫BALB/c小鼠，應(yīng)用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備抗人整合素β3亞基的單克隆抗體(mAb),通過(guò)小鼠體內(nèi)抑制黑色素瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和體外抑制HUVEC細(xì)胞增殖及促進(jìn)HUVEC細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)篩選出具有抑制腫瘤生長(zhǎng)作用的單抗。并從分泌此單抗的雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA，用小鼠抗體可變區(qū)基因的通用引物，以RT—PCR的方法擴(kuò)增出抗B3抗體的重鏈可變區(qū)(v

3、H)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因，再通過(guò)PCR的方法在VH和VL基因間插入柔性連接子(G1y4Ser)3，構(gòu)建出抗β3抗體的ScFv基因。將其克隆至原核表達(dá)載體pQE30中，獲得抗β3單鏈抗體基因的高效表達(dá)載體pQE30-β3-ScFv，轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化和凝膠柱上在位復(fù)性，用EUSA的方法鑒定其結(jié)合β3抗原活性。 【結(jié)果】擴(kuò)增獲得了β3胞膜外基因，構(gòu)建了β3蛋白的原核表達(dá)載體，表達(dá)純化了β3

4、蛋白，成功制備了8株抗人整合素β3亞基的單克隆抗體。經(jīng)過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)篩選出一株具有顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)的單抗4F12。通過(guò)基因工程抗體技術(shù)獲得4F12抗體的VH和VL基因，并構(gòu)建出抗β3抗體的ScFv基因，在大腸桿菌中獲得了表達(dá)，表達(dá)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為26×103，主要以包涵體形式存在。經(jīng)金屬螯合親和層析柱(Ni-NTAagarose)純化和凝膠柱上在位復(fù)性后，EUSA結(jié)果證實(shí)其具有良好的結(jié)合β3抗原活性。 【結(jié)論】成功地獲得了