鼠源性人腫瘤單鏈抗體庫的構(gòu)建及乳腺癌相關(guān)抗體的篩選.pdf

1、本研究是本室構(gòu)建抗體庫平臺的一個組成部分。通過鼠源性人腫瘤單鏈抗體庫的構(gòu)建及腫瘤相關(guān)抗體的篩選，旨在有助于本室更好地開展腫瘤分子生物學(xué)的研究工作，有助于腫瘤的診斷與治療。 實驗首先用乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T47D、MDA-MB-435免疫BALB/c小鼠，待達(dá)到合適免疫效價后取鼠脾臟淋巴細(xì)胞提取總RNA，通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用鼠VH、VL特異性引物擴(kuò)增出VH、VLcDNA，并用Linker連接VH、VL，構(gòu)成單

2、鏈抗體(scFv)基因片段，隨后將單鏈抗體(scFv)基因片段插入pCANTAB5E載體，電轉(zhuǎn)化TG1菌，獲得庫容為1.3×106的單鏈抗體庫。 在用抗體庫篩選實驗中，主要選乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和人正常肝細(xì)胞系HL02做正負(fù)差異篩選模型，運(yùn)用固相和液相篩選方法，篩選到兩株腫瘤相關(guān)抗體：scFv-873和scFv-874。通過數(shù)據(jù)庫搜索，發(fā)現(xiàn)這兩株單鏈抗體基因是與以往抗體序列不同的新基因。 將含這兩種抗體基因的噬菌粒載體

3、轉(zhuǎn)入琥珀密碼子非抑制型菌株TOP10中，誘導(dǎo)表達(dá)后，用Westernblot檢測，scFv-874具有明顯的分泌性表達(dá)，并且在周質(zhì)及全細(xì)胞中都可以表達(dá)；而scFv-873未檢測出明顯的分泌性表達(dá)，只在全細(xì)胞中可以表達(dá)。遂將這兩個scFvs基因插入pTIG-Trx表達(dá)載體中，在BL21(DE3)中實現(xiàn)了游離形式的可溶性表達(dá)，并經(jīng)鎳柱(Ni-NTA)得到有效純化。 本研究獲得了針對人腫瘤細(xì)胞的相關(guān)抗體，并實現(xiàn)了可溶性表達(dá)和純化，為下