金黃色葡萄球菌RsmA蛋白以及釀酒酵母ISW2染色體重塑復(fù)合物的結(jié)構(gòu)初探.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　1.金黃色葡萄球菌RsmA蛋白的初步晶體學(xué)研究
　　金黃色葡萄球菌是一種重要的致病菌，是人類化膿感染中最常見的病原菌，能夠引起局部化膿感染。抑制金黃色葡萄球菌感染的一種方式是抑制其相關(guān)毒性蛋白及毒性分子的表達(dá)。
　　RsmA蛋白是金黃色葡萄球菌中的一種16S rRNA小亞基甲基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)將16S rRNA3'端第一個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)區(qū)兩個(gè)連續(xù)的腺嘌呤進(jìn)行甲基化，并且能夠使每個(gè)腺嘌呤第6位的氮原

2、子發(fā)生一個(gè)雙甲基化反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)RsmA蛋白的缺失會(huì)影響30S小亞基的生物合成，進(jìn)而影響到蛋白質(zhì)的相關(guān)翻譯過(guò)程。
　　對(duì)于該部分研究試圖通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法探究RsmA蛋白催化腺嘌呤發(fā)生雙甲基化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，通過(guò)結(jié)構(gòu)分析找到RsmA上潛在的靶向小分子藥物位點(diǎn)，通過(guò)設(shè)計(jì)藥物來(lái)抑制金黃色葡萄球菌感染。于是我們進(jìn)行了RsmA蛋白的克隆、表達(dá)、純化并對(duì)Native和SeMet-RsmA蛋白進(jìn)行了晶體生長(zhǎng)，收到了一套3.2(A)的數(shù)據(jù)，通過(guò)數(shù)

3、據(jù)處理了解了RsmA蛋白的一些初步晶體學(xué)數(shù)據(jù)，通過(guò)ITC實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了RsmA對(duì)SAM和SAH的結(jié)合，并進(jìn)行了RsmA與SAM和SAH的共結(jié)晶，通過(guò)晶體篩選獲得了復(fù)合物的晶體，但質(zhì)量并不高有待進(jìn)一步優(yōu)化。
　　2.釀酒酵母中的ISW2染色體重塑復(fù)合物的結(jié)構(gòu)探索
　　真核生物體內(nèi)，染色質(zhì)以核小體的形式存在，這種包裝結(jié)構(gòu)非常緊密，使得轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白不能結(jié)合到DNA上，影響基因的表達(dá)。ATP依賴的染色體重塑復(fù)合物可以利用ATP水解釋放的

4、能量對(duì)核小體進(jìn)行移動(dòng)，組裝，替換，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞中染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，對(duì)基因的表達(dá)情況起到調(diào)控作用。在釀酒酵母中存在一種保守的ATP依賴的染色體重塑復(fù)合物ISWI家族，包含有ISW1和ISW2兩種主要的重塑復(fù)合物。其中ISW2染色體重塑復(fù)合物含有Isw2、Itc1、Opb4和Dls1四個(gè)組分，該復(fù)合物可以調(diào)控核小體串聯(lián)的間隔，發(fā)揮重塑功能。相比于ISW1，ISW2蛋白在發(fā)生重塑過(guò)程中對(duì)于核小體間的鏈接DNA的長(zhǎng)度是沒有要求的，并且對(duì)于核

5、小體的結(jié)構(gòu)不會(huì)起到破壞作用。
　　對(duì)于這部分工作，嘗試通過(guò)解析該復(fù)合物及其各組分的結(jié)構(gòu)來(lái)探究其重塑的機(jī)理。我們對(duì)于ISW2各個(gè)組分進(jìn)行了克隆、表達(dá)、純化并進(jìn)行了晶體生長(zhǎng)，獲得了Isw2單體的晶體。通過(guò)EMSA實(shí)驗(yàn)和pull-down實(shí)驗(yàn)探究了Isw2和Dpb4+Dls1對(duì)于雙鏈DNA的結(jié)合能力以及Isw2與Dpb4+Dls1相互作用的片段，嘗試了Isw2、Dpb4+Dls1+dsDNA和Isw2片段+Dpb4+Dls1的共晶。與此