芽孢桿菌PCR鑒定方法的建立和應用.pdf

1、準確快速鑒定產品中的微生物種類是保障微生物肥料安全和有效的前提.傳統(tǒng)的鑒定方法存在一些不足的地方,費時費力,有時又準確度不高,分子鑒定方法是解決微生物肥料質量檢測中菌種判定難、效率低的有效途徑,但目前應用仍較少.本文根據(jù)種特異性基因序列設計引物,利用聚合酶鏈式反應(PCR)建立一套簡單、快速鑒定7種常見芽孢桿菌的方法,從而為微生物肥料產品的質量和安全性檢驗提供技術支持. 1.通過基因序列的同源性分析,篩選出具有種(群)特異性的基

2、因作為PCR的靶序列.利用軟件設計了枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢桿菌 (B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌 (B.licheniformis)、短小芽孢桿菌 (B.pumilus)、巨大芽孢桿菌 (B.megaterium)、蠟樣群芽孢桿菌 (B.cereus group)、膠胨樣群芽孢桿菌 (B.mucilaginosus group) 的引物,通過互聯(lián)網(wǎng)比較分析得到 7 對具有

3、種群特異性的引物.設計篩選的引物分別是:根據(jù) rpoA 基因設計了引物B.subtilis BSL72/ BSR328,依據(jù) gyrA 基因設計了引物 B.amyloliquefaciens L100/R836 和 B.licheniformis L168/R514,在 spoOA 基因的基礎上設計的引物 B.megaterium BML257/BMR700和引物 B.cereus group L214/625,根據(jù) 16S rRNA

4、基因設計了引物 B.mucilaginosus group L415/R1008和引物 B.pumilus L354/R674. 2. 采用設計的種特異引物,通過優(yōu)化PCR反應的退火溫度、引物濃度、Mg<'+>濃度等關鍵因子,分別建立了不同種(群)的特異PCR反應體系.經(jīng)過3個屬15個種的模式菌株和(或)標準菌株(共41株)的實驗驗證,每個反應體系在種(群)內均能擴增出目標條帶,而與其他種群中無交叉反應(僅短小芽孢桿菌和巨大芽孢

5、桿菌引物與部分菌株有陽性反應),顯示了良好的特異性.在靈敏度測試中,每個反應體系至少能檢測到100 pg濃度的基因組DNA,而枯草芽孢桿菌和膠胨樣群芽孢桿菌的敏感性達到了10pg,較高的靈敏度滿足PCR鑒定和檢測菌種的要求,微生物含量較低的樣品中也能擴增出目標條帶.PCR技術鑒定不僅可以準確鑒定不同種(群)的菌株,而且還能重新界定菌株的歸屬,在本文中將參考菌株CGMCC1.15、1.108、1.354 從枯草芽孢桿菌中歸類至解淀粉芽孢桿

6、菌. 3. 在單重PCR基礎上分別建立了枯草群復合PCR反應體系(含四對引物)和巨大/蠟樣群復合PCR體系(含兩對引物),其中枯草群復合PCR反應可同時鑒定或鑒別枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌,巨大芽孢桿菌和蠟樣群芽孢桿菌的復合PCR反應可同時鑒定或鑒別巨大芽孢桿菌和蠟樣群芽孢桿菌.經(jīng)過3個屬15個種的模式菌株和(或)標準菌株特異性驗證,復合PCR.反應具有良好的特異性和敏感性,與單重PCR特異性一致,

7、只是靈敏度有所下降(約一個數(shù)量級),在100～1000 pg范圍內,在大量、快速鑒定和鑒別枯草群和巨大/蠟樣群芽孢桿菌中具有重要意義. 4. 對產品中23株枯草群菌株、10株巨大芽孢桿菌和蠟樣群芽孢桿菌、10株疑似膠胨樣群芽孢桿菌的基因組:DNA進行的PCR擴增結果和典型生化實驗結果顯示:所有枯草群菌株均有擴增產物,依據(jù)產物大小判斷的菌株分類地位與生化實驗結果一致,巨大和蠟樣群菌株亦是如此;疑似膠胨樣群菌株中有擴增產物的菌株表現(xiàn)

8、典型的培養(yǎng)特征和菌體特征,而非膠胨樣群菌株則無擴增產物,在菌落或菌體方面與其存在顯著差異.因此特異PCR技術用于鑒定生產菌種準確可靠,具有良好的應用價值. 5. 通過產品特征的分析和研究,建立了產品洗滌、菌體懸浮、珠式破碎、酚-氯仿-異丙醇抽提的微生物肥料產品DNA提取方法,解決了微生物肥料中腐植質含量高難去除和芽孢難破壁的DNA提取難題.使用該方法獲得的樣品DNA為無色或淺棕色,大小約9Kb,經(jīng)過PcR擴增,液體樣品的PCR靈

9、敏性達到10<'4>-10<'5>CFU/mL,固體草炭樣品靈敏度達到10<'7>CFU/0.2g.雖然該方法DNA損失較多,敏感性稍差,但是成本低,效率高,可直接用于PCR,為PCR方法直接檢測產 6. 利用以上DNA提取技術獲得16個微生物肥料產品的DNA,經(jīng)過特異PCR擴增,除了兩個產品中一種目標微生物含量太低(低于檢測限)無擴增產物外,其他產品均有目標菌的擴增產物,根據(jù)擴增條帶的大小對產品的鑒定與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)及生化鑒定結

10、果一致,而且PCR反應的特異性沒有受到產品中其他微生物的干擾.實驗結果表明本文建立的種(群)特異PCR技術和DNA提取方法可用于微生物肥料產品的直接檢測,在提高微生物肥料的檢測水平和檢測效率方面有著巨大的應用潛力. 通過大量參考菌株和生產菌株以及微生物肥料產品的試驗表明:基于序列分析和種(群)特異引物的基礎上建立的單重PCR和復合PCR方法,在鑒定和鑒別7個種(群)的芽孢桿菌菌株上具有快速、準確、敏感的優(yōu)點,該方法不僅能夠用于純