奶牛乳樣和糞樣中幽門(mén)螺桿菌PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)與上消化道及胃腸道外的多系統(tǒng)疾病相關(guān)，但至今其感染人的傳染源和傳播途徑仍不明確。研究表明Hp可能是種食源性致病菌，而牛乳、羊乳是其中最可能的感染來(lái)源。目前，在幽門(mén)螺桿菌感染的眾多診斷方法中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相關(guān)技術(shù)因靈敏度高，能檢出樣品中微量的Hp，而廣泛應(yīng)用于各臨床樣品中Hp的檢測(cè)。本試驗(yàn)分別以幽門(mén)螺桿菌16Sr RNA、UreA、glmM基因?yàn)榘谢颍O(shè)計(jì)特異性引物，建立奶牛乳

2、樣和糞樣中幽門(mén)螺桿菌的PCR檢測(cè)方法，并成功應(yīng)用于奶牛臨床樣品的檢測(cè)。
　　1、Hp PCR檢測(cè)方法的建立:根據(jù)NCBI上已公布的Hp16S rRNA、UreA、glmM基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物。提取H pylori動(dòng)物模型適應(yīng)菌株SS1株菌液(1×108CFU/ML) DNA作為PCR模板。模板濃度、退火溫度、引物濃度及循環(huán)數(shù)等PCR反應(yīng)體系及條件經(jīng)優(yōu)化后得到以下結(jié)果:25μL反應(yīng)體系中，加入2μL模板DNA，16SrRNA、U

3、reA、glmM基因分別在退火溫度為58℃～60℃、48℃～50℃、58℃～60℃時(shí)能擴(kuò)增出777bp、411bp、294bp的目的條帶;其中上下游引物(10μM)各0.4μL～0.6μL，循環(huán)數(shù)為32～35個(gè)時(shí)擴(kuò)增效果最好。在此條件下，16S rRNA、UreA、glmM檢測(cè)的靈敏度分別為101 CFU/ML、103 CFU/ML、103 CFU/ML。同時(shí)對(duì)比乳樣、糞樣樣品基質(zhì)條件下PCR檢測(cè)靈敏度發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用UreA、glmM基因檢

4、測(cè)人工污染的奶牛糞樣中幽門(mén)螺桿菌時(shí)，靈敏性有所下降，為104 CFU/ML。由此可得，本試驗(yàn)建立的PCR方法快速、特異、靈敏、高效，為檢測(cè)奶牛攜帶幽門(mén)螺桿菌的情況奠定了基礎(chǔ)。
　　2、Hp PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用:采集規(guī)?；B(yǎng)殖及散養(yǎng)的共計(jì)41頭奶牛的乳樣和糞樣進(jìn)行檢測(cè)，成功檢出Hp DNA。16S rRNA、UreA、glmM于奶牛乳樣中Hp的檢出率分別為58.34％、34.15％、14.63％，而糞樣中16S rRNA、UreA