IHHNV和LCDV實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、傳染性皮下及造血器官壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV)可感染世界各地養(yǎng)殖對(duì)蝦，給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。本研究首次采用實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)廣西地區(qū)的84份凡納濱對(duì)蝦樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以常規(guī)PCR檢測(cè)作對(duì)照。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為79.8％，常規(guī)PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為40.5％，且常規(guī)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的樣品均包含在實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性之

2、中，也表明廣西地區(qū)養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦IHHNV的感染率較高。將兩者檢測(cè)均呈陽(yáng)性的30份樣品擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNA STAR軟件包進(jìn)行分析，并通過(guò)NCBI Blast與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果證明測(cè)定的是IHHNV序列。30份樣品的IHHNV序列很保守，可以分為4種類(lèi)型，僅有兩個(gè)堿基的位置發(fā)生變異。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IHHNV，快速、靈敏、準(zhǔn)確，特異性好，可以作為檢測(cè)對(duì)蝦感染病毒的有效方法。 淋巴囊

3、腫病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)廣泛分布于世界各地的淡水、半咸水和海水中，可感染9目34科計(jì)140種以上魚(yú)類(lèi)。淋巴囊腫病是對(duì)魚(yú)類(lèi)危害較為嚴(yán)重的病毒病之一，其感染率可高達(dá)80％，死亡率可達(dá)30％。本研究建立Taqman、SYBR Creen I實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)淋巴囊腫病毒。選取LCDV的主要衣殼蛋白(major capsid protein，MCP)基因保守序列，利用Primer Expres

4、s 2.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針。 Taqman實(shí)時(shí)定量PCR中，以梯度稀釋的含有LCDV目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，質(zhì)粒濃度為3×107～30個(gè)拷貝內(nèi)都有擴(kuò)增曲線，檢測(cè)限為30個(gè)病毒拷貝。根據(jù)病毒拷貝數(shù)(X)與Ct值的關(guān)系，制備了標(biāo)準(zhǔn)曲線?？截悢?shù)(X)與Ct的關(guān)系為：Ct=-3.631gX+41.86，相關(guān)系數(shù)R2=0.9915。特異性實(shí)驗(yàn)中，Taqman實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)流行性造血器官壞死病毒(Epizootic

5、 haematopoietic necrosis virus，EHNV)、蛙虹彩病毒(Bohle iridovirus，BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)、真鯛虹彩病毒(Sea bream iridovirus，RSIV)都沒(méi)有擴(kuò)增反應(yīng)。利用建立的方法對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖場(chǎng)的魚(yú)類(lèi)進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到12批LCDV陽(yáng)性樣品，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)病毒進(jìn)行了定量分析。將陽(yáng)性樣品的常規(guī)PCR產(chǎn)物進(jìn)

6、行純化測(cè)序，證實(shí)是LCDV序列。Taqman實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)LCDV，靈敏度高，特異性好，可以進(jìn)行定量分析，可成為一種早期檢測(cè)LCDV的新方法。 SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR中，優(yōu)化了定量PCR的反應(yīng)條件，反應(yīng)體系的最佳引物濃度為0.5μM。該方法能特異檢測(cè)出淋巴囊腫病毒，不能擴(kuò)增流行性造血器官壞死病毒(Epizootic haematopoietic necrosis virus，EHNV)、虎紋蛙病毒(Tiger

7、 frog virus，TFV)、蛙虹彩病毒(Bohle iridovirus，BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)、鱖魚(yú)傳染性脾腎壞死病毒(Infectiousspleen and kidney necrosis virus，ISKNV)及真鯛虹彩病毒(Sea bream iridovirus,RSIV)。利用該方法對(duì)12份發(fā)病牙鲆魚(yú)樣品進(jìn)行檢測(cè)，均呈陽(yáng)性。重復(fù)性測(cè)試中，S