炭疽芽孢桿菌和霍亂弧菌實時定量PCR快速檢測體系的建立及評價.pdf

1、背景：炭疽是一種多見于在動物間傳播的傳染性疾病，其傳染源為炭疽芽孢桿菌的芽孢。炭疽這個名稱來源于希臘語中的煤炭(anthrakis)，因為特異性的黑痂為該疾病的主要特征。17世紀的歐洲曾發(fā)生過一次炭疽大流行，導致約6萬人喪生。1954年，炭疽毒素(toxin)在炭疽致病中的作用被闡明。2001年，炭疽首次被真正作為生化武器用于恐怖襲擊。炭疽可分為三種臨床型：皮膚炭疽、腸炭疽、肺炭疽，其中皮膚炭疽可以通過特異性的臨床表現(xiàn)(炭樣黑色痂皮)和

2、細胞培養(yǎng)進行確診；而腸炭疽和肺炭疽則因易與其他腸道和肺部疾病混淆而不易診斷，因此，實驗室診斷方法成為了有效的輔助診斷方法，如聚合酶鏈反應(PCR)、血清學檢查(PA.based EIASA)以及相關組織的免疫組化檢測等。隨著檢測技術的不斷發(fā)展，越來越多的檢測方法被用于各種細菌的檢測中，其中實時定量PCR技術以其快速、通用、高效、全封閉反應等優(yōu)點越來越受到科研及臨床工作者的歡迎，特別是在防止恐怖襲擊方面，能夠高效快速的檢測出炭疽桿菌，對防

3、止生化武器污染極為重要。本研究，我們建立了快速鑒別炭疽芽孢桿菌的單重和多重實時定量PCR體系，并用相關菌種進行了該檢測體系的特異性評價，以及用臨床模擬糞便標本對該體系開展了臨床應用價值的評價。 目的：以炭疽芽孢桿菌的主基因組特異性序列GS和毒素質粒(pXO1)上的致病毒素基因pagA特異性序列為檢測靶點，建立高敏感、高特異的熒光單重和雙重實時TaqMan聚合酶鏈反應快速檢測體系，并將該體系應用于臨床模擬標本的檢測，以驗證其開展實

4、際臨床應用的價值。 方法：根據(jù)炭疽桿菌主基因組特異性序列(GS)和特異的毒力島pagA基因序列(pagA)設計相應的引物和探針，構建含目的基因序列的質粒作為標準模板，利用TaqMan標記探針和Cepheid公司的便攜式Smart Cycler Ⅱ進行實時聚合酶鏈反應，建立炭疽芽孢桿菌基因快速檢測體系，評價該檢測體系的檢測敏感性和特異性，同時用從炭疽滅活疫苗和臨床模擬標本中提取的基因組DNA對該體系進行了臨床應用價值的評價。

5、 結果：該實時定量PCR檢測體系中單基因檢測位點檢測體系(單重檢測體系)在檢測炭疽芽孢桿菌質粒標準品時的檢測敏感度達101copies/reaction，檢測炭疽芽孢桿菌滅活疫苗基因組DNA標本時的檢測敏感度達100fg/reaction，檢測糞便模擬標本時的檢測敏感度達102CFU/reaction：雙基因檢測位點檢測體系(雙重檢測體系)在檢測質粒標準品時的檢測敏感度達102copies/reaction，檢測疫苗基因組DNA標本時

6、的檢測敏感度達1pg/reaction，檢測糞便模擬標本時的檢測敏感度達102CFU/reaction。該檢測體系不論單重還是雙重檢測體系均達到較高水平的敏感度，該檢測體系在檢測其他蠟樣桿菌群細菌時未出現(xiàn)非特異性擴增，具有較高的特異性。整個實時聚合酶鏈反應在1h內完成，適合于實驗室或野外環(huán)境下炭疽芽孢桿菌的快速檢測。 結論：本研究建立的單重及雙重TaqMan實時聚合酶鏈反應檢測體系可作為炭疽芽孢桿菌快速、準確、特異、敏感的檢測手