炭疽芽孢桿菌和霍亂弧菌實(shí)時(shí)定量PCR快速檢測(cè)體系的建立及評(píng)價(jià).pdf

1、背景：炭疽是一種多見(jiàn)于在動(dòng)物間傳播的傳染性疾病，其傳染源為炭疽芽孢桿菌的芽孢。炭疽這個(gè)名稱來(lái)源于希臘語(yǔ)中的煤炭(anthrakis)，因?yàn)樘禺愋缘暮陴铻樵摷膊〉闹饕卣鳌?7世紀(jì)的歐洲曾發(fā)生過(guò)一次炭疽大流行，導(dǎo)致約6萬(wàn)人喪生。1954年，炭疽毒素(toxin)在炭疽致病中的作用被闡明。2001年，炭疽首次被真正作為生化武器用于恐怖襲擊。炭疽可分為三種臨床型：皮膚炭疽、腸炭疽、肺炭疽，其中皮膚炭疽可以通過(guò)特異性的臨床表現(xiàn)(炭樣黑色痂皮)和

2、細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行確診；而腸炭疽和肺炭疽則因易與其他腸道和肺部疾病混淆而不易診斷，因此，實(shí)驗(yàn)室診斷方法成為了有效的輔助診斷方法，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、血清學(xué)檢查(PA.based EIASA)以及相關(guān)組織的免疫組化檢測(cè)等。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的檢測(cè)方法被用于各種細(xì)菌的檢測(cè)中，其中實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)以其快速、通用、高效、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到科研及臨床工作者的歡迎，特別是在防止恐怖襲擊方面，能夠高效快速的檢測(cè)出炭疽桿菌，對(duì)防

3、止生化武器污染極為重要。本研究，我們建立了快速鑒別炭疽芽孢桿菌的單重和多重實(shí)時(shí)定量PCR體系，并用相關(guān)菌種進(jìn)行了該檢測(cè)體系的特異性評(píng)價(jià)，以及用臨床模擬糞便標(biāo)本對(duì)該體系開(kāi)展了臨床應(yīng)用價(jià)值的評(píng)價(jià)。 目的：以炭疽芽孢桿菌的主基因組特異性序列GS和毒素質(zhì)粒(pXO1)上的致病毒素基因pagA特異性序列為檢測(cè)靶點(diǎn)，建立高敏感、高特異的熒光單重和雙重實(shí)時(shí)TaqMan聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測(cè)體系，并將該體系應(yīng)用于臨床模擬標(biāo)本的檢測(cè)，以驗(yàn)證其開(kāi)展實(shí)

4、際臨床應(yīng)用的價(jià)值。 方法：根據(jù)炭疽桿菌主基因組特異性序列(GS)和特異的毒力島pagA基因序列(pagA)設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和探針，構(gòu)建含目的基因序列的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)模板，利用TaqMan標(biāo)記探針和Cepheid公司的便攜式Smart Cycler Ⅱ進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)，建立炭疽芽孢桿菌基因快速檢測(cè)體系，評(píng)價(jià)該檢測(cè)體系的檢測(cè)敏感性和特異性，同時(shí)用從炭疽滅活疫苗和臨床模擬標(biāo)本中提取的基因組DNA對(duì)該體系進(jìn)行了臨床應(yīng)用價(jià)值的評(píng)價(jià)。

5、 結(jié)果：該實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)體系中單基因檢測(cè)位點(diǎn)檢測(cè)體系(單重檢測(cè)體系)在檢測(cè)炭疽芽孢桿菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的檢測(cè)敏感度達(dá)101copies/reaction，檢測(cè)炭疽芽孢桿菌滅活疫苗基因組DNA標(biāo)本時(shí)的檢測(cè)敏感度達(dá)100fg/reaction，檢測(cè)糞便模擬標(biāo)本時(shí)的檢測(cè)敏感度達(dá)102CFU/reaction：雙基因檢測(cè)位點(diǎn)檢測(cè)體系(雙重檢測(cè)體系)在檢測(cè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的檢測(cè)敏感度達(dá)102copies/reaction，檢測(cè)疫苗基因組DNA標(biāo)本時(shí)

6、的檢測(cè)敏感度達(dá)1pg/reaction，檢測(cè)糞便模擬標(biāo)本時(shí)的檢測(cè)敏感度達(dá)102CFU/reaction。該檢測(cè)體系不論單重還是雙重檢測(cè)體系均達(dá)到較高水平的敏感度，該檢測(cè)體系在檢測(cè)其他蠟樣桿菌群細(xì)菌時(shí)未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，具有較高的特異性。整個(gè)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)在1h內(nèi)完成，適合于實(shí)驗(yàn)室或野外環(huán)境下炭疽芽孢桿菌的快速檢測(cè)。 結(jié)論：本研究建立的單重及雙重TaqMan實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)體系可作為炭疽芽孢桿菌快速、準(zhǔn)確、特異、敏感的檢測(cè)手