低密度脂蛋白偶聯(lián)N-琥珀酰殼聚糖硫辛酸膠束作為腫瘤靶向系統(tǒng)的研究.pdf

1、目的：以合成的N-琥珀酰殼聚糖硫辛酸(N-succinyl chitosanlipoic acid，NSC-LA)為載體，紫杉醇為模型藥物，低密度脂蛋白（LDL）與一端經(jīng)膽固醇修飾過的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)形成siRNA/LDL復(fù)合物，制備siRNA/LDL偶聯(lián)的N-琥珀酰殼聚糖硫辛酸載藥膠束，LDL作為基因載體的同時作為靶向配體，使得 LDL偶聯(lián)的載藥膠束具備主動靶向和被動靶向雙重作用

2、，能增加紫杉醇的藥敏性，而且由此構(gòu)成的特異性腫瘤靶向聚合體能緩解解決多藥耐藥這一現(xiàn)象。
　　方法：⑴采用溴化鉀密度梯度離心法分離出人血漿中的LDL，并驗證 LDL的體外靶向性。合成 N-琥珀酰殼聚糖硫辛酸聚合物（NSC-LA），通過紅外光譜、1H-NMR表征其結(jié)構(gòu)，將LDL與膽固醇修飾的siRNA共孵育制成siRNA/LDL復(fù)合物，與載體共價連接制得基因藥物共轉(zhuǎn)運膠束，并利用紅外光譜對其進行表征。制備共轉(zhuǎn)運膠束 PTX-siRNA

3、/LDL-NSC-LA，考察膠束在不同介質(zhì)中的釋放特性，對其粒徑、形態(tài)和表面電勢進行了考察。⑵利用體外溶血試驗和MTT試驗考察膠束的體外安全性。⑶考察了共轉(zhuǎn)運膠束的細胞毒性；通過不同抑制劑研究納米粒的細胞攝取機制，對膠束中siRNA的轉(zhuǎn)染效果和mRNA水平和蛋白水平逆轉(zhuǎn)耐藥性進行研究。（4）建立皮下瘤模型，以DiR標記納米粒，利用小動物活體成像技術(shù)考察膠束的體內(nèi)分布。
　　結(jié)果：①分離得到的LDL與參考文獻一致，其攝取由LDL受體

4、介導(dǎo)。通過紅外光譜、1H-NMR和透射電鏡結(jié)果表明LDL與載藥膠束已經(jīng)成功偶聯(lián)。siRNA/LDL復(fù)合物的最佳復(fù)合摩爾比為30:1，復(fù)合物的血清穩(wěn)定性良好且LDL對siRNA具有酶保護作用。LDL偶聯(lián)的基因藥物共轉(zhuǎn)運膠束平均粒徑為（171.6±6.42）nm，Zeta電位為（-22.52±0.47）mV，包封率和載藥量分別為（93.92±1.06）％和（14.45±0.78）%。透射電鏡照片顯示膠束外觀較圓整，粒徑分布均勻。聚合物膠束在

5、具有還原性物質(zhì)的酸性條件下更容易釋放藥物。②與原料藥相比，制備的二元體聚合物膠束與血液幾乎不相溶；空白載體LDL-NSC-LA對腫瘤細胞毒性較低。③與原料藥和未修飾膠束相比，LDL偶聯(lián)的膠束對MCF-7和MCF-7/Taxol的細胞毒性更強，而對正常小鼠成纖維細胞L929的毒性較弱。膠束可能通過網(wǎng)格蛋白和細胞質(zhì)膜微囊介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進入細胞，其中還可能有SR-B族受體的參與。脂筏結(jié)構(gòu)的完整性對 LDL偶聯(lián)納米粒的攝取也具有顯著影響。體外轉(zhuǎn)

6、染、RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)運納米粒能有效轉(zhuǎn)染進入細胞并在mRNA水平和蛋白水平抑制耐藥基因的表達。④小動物活體成像實驗顯示膠束對皮下瘤具有較好的靶向性。
　　結(jié)論：基因藥物共轉(zhuǎn)運膠束的制備工藝簡單易行，方法穩(wěn)定。LDL偶聯(lián)的膠束對腫瘤細胞更具親和力，能在腫瘤微環(huán)境作出pH敏感和還原敏感智能化響應(yīng)，能有效轉(zhuǎn)染siRNA進入細胞抑制耐藥基因的表達，LDL作為基因載體的同時作為靶向配體，共轉(zhuǎn)運基因和藥物來治