基于對(duì)蛋白質(zhì)色氨酸殘基熒光猝滅的均相親和分析方法及其應(yīng)用.pdf

1、以蛋白質(zhì)中色氨酸或酪氨酸殘基為熒光共振能量轉(zhuǎn)移供體,熒光探針作為FRET接受體可進(jìn)行均相親和分析;FRET探針需包含作為蛋白色氨酸接受體的熒光團(tuán)和蛋白特異性配體兩部分;形成復(fù)合物后激發(fā)色氨酸測(cè)定FRET效應(yīng)可確定復(fù)合物的量，從而建立對(duì)應(yīng)的均相親和分析系統(tǒng)。理論上，此法可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定非熒光配體、非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定對(duì)應(yīng)蛋白、滴定分析標(biāo)定對(duì)應(yīng)蛋白含量、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定非熒光配體親和力等。這些應(yīng)用的關(guān)鍵是獲得所需FRET探針。
　　本文第一部分建

2、立了一種均相測(cè)定白蛋白(ALB)含量的熒光新方法。該法利用熒光探針8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)與白蛋白在特定條件下的高親和力結(jié)合，在280 nm和350 nm波長(zhǎng)激發(fā)下同時(shí)測(cè)定形成的復(fù)合物在470 nm的熒光發(fā)射信號(hào)來(lái)測(cè)定血清中白蛋白的含量。ANS是白蛋白的非特異性熒光配體，親和力中等;在結(jié)合的ANS和白蛋白色氨酸殘基之間的FRET現(xiàn)象早已報(bào)道。ANS與ALB復(fù)合物有適度的量子產(chǎn)率，但ANS在緩沖水溶液中的信號(hào)可忽略，故游離ANS在2

3、80nm處激發(fā)不會(huì)造成高本底，可測(cè)定白蛋白和ANS復(fù)合物的熒光。ANS與白蛋白的結(jié)合涉及疏水和靜電相互作用，用低離子強(qiáng)度緩沖液和稍低pH值可提高ANS與白蛋白親和力。用Matlab擬合ANS滴定ALB和ALB滴定ANS曲線得到解離常數(shù)(Kd)接近0.15μM。此外，280nm激發(fā)下復(fù)合物中FRET效應(yīng)進(jìn)一步提高ANS作為生物傳感器測(cè)定白蛋白靈敏度和選擇性。通過(guò)對(duì)50例白蛋白濃度15～55 g/L臨床血清標(biāo)本測(cè)定，變異系數(shù)為5％以下。同時(shí)

4、新方法對(duì)于常見(jiàn)的球蛋白，對(duì)潛在的干擾物青霉素和肝素，以及其他常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有更好的抗干擾能力。同時(shí)結(jié)果顯示在280或350納米激發(fā)，與溴甲酚綠法(BCG)呈良好的相關(guān)性，且Bland-Altman分析證明了兩種的一致性;與免疫比濁法測(cè)定結(jié)果相關(guān)性很高，且Bland-Altman分析證明二者一致。特殊的是，280 nm激發(fā)產(chǎn)生FRET效應(yīng)對(duì)應(yīng)的方法抗干擾能力、與免疫比濁法測(cè)定結(jié)果的一致性還高于BCG法。可見(jiàn)，利用與蛋白結(jié)合產(chǎn)物的量子產(chǎn)率增

5、加效應(yīng)及復(fù)合物內(nèi)部的FRET效應(yīng)設(shè)計(jì)檢測(cè)特定蛋白的熒光探針，其測(cè)定的特異性和靈敏度更好。
　　本文第二部分建立了一種基于對(duì)單抗的色氨酸熒光淬滅作用，從頭校準(zhǔn)單克隆抗體含量的新方法。單克隆抗體（單抗）是生物分析必不可少的生物材料。在實(shí)際應(yīng)用中，單克隆抗體的含量應(yīng)準(zhǔn)確校準(zhǔn)跟蹤。六組氨酸(6His)被廣泛用于蛋白質(zhì)和融合表達(dá)及其單克隆抗體(單抗-6His)是用于檢測(cè)的6His-標(biāo)簽的目的蛋白。單抗-6His中使用的6His滴定曲線作為非

6、熒光探針可以記錄在340nm處熒光。另一方面，丹磺酰胺是色氨酸殘基的受體，而丹磺酰的6His(DNS-6His)作為FRET探針記錄滴定曲線在540 nm熒光發(fā)射或340hm熒光猝滅，單抗-6His中的滴定曲線的擬合記錄為熒光在340 nm處具有任一探針遇到不收斂為單抗-6His中的量化。這兩種類型的單克隆抗體的探頭可以有足夠的純度進(jìn)行跟蹤。根據(jù)單克隆抗體激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm的兩種類型的探針的滴定曲線，可以在340 nm處記錄熒光，且

7、通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移的探針也可記錄探針的熒光，滴定曲線的分析可以校正結(jié)合位點(diǎn)單抗含量，從而證明這種方法是有效和普遍適用的。
　　本文第三部分設(shè)計(jì)合成低親和力鏈親和素?zé)晒馓结樆贔RET和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定生物素。鏈霉親和素（Streptavidin，SA）與生物素的解離常數(shù)為10-15M，親和力是抗原抗體反應(yīng)（10-5～10-11M）的1萬(wàn)倍以上。設(shè)計(jì)并合成了四種低親和力鏈親和素?zé)晒馓结槪ㄟ^(guò)聚乙二醇單甲醚(mPEG)或季胺堿陽(yáng)性離子的