鹽生杜氏藻EPSP合成酶基因的克隆、功能鑒定及其結(jié)構(gòu)的光譜學性質(zhì)分析.pdf

1、草甘膦是目前使用最為廣泛的一種廣譜性除草劑，具有對人畜低毒，低殘留，不破壞生態(tài)環(huán)境，雜草難對之產(chǎn)生抗性等優(yōu)點，有很高的商業(yè)價值。草甘膦作用的靶標酶是EPSP合成酶(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶，5-enolpyr- uvyl-shikimate-3-phosphate synthase)。該酶是催化莽草酸循環(huán)途徑第六步反應的酶，是細菌、真菌以及植物體內(nèi)芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)生物合成過程中的一個關鍵酶。草甘膦就是

2、通過抑制EPSP合成酶活性從而阻斷芳香族氨基酸的合成，來滅殺大多數(shù)的植物，雜草和農(nóng)作物皆不例外。因此，利用基因工程技術，通過改造EPSP合成酶或提高EPSP合成酶的表達量以提高作物對草甘膦的抗性，以擴大草甘膦的應用范圍，是當今雜草科學和作物育種領域研究的重要內(nèi)容。 除此而外，由于莽草酸循環(huán)僅僅存在于植物、細菌和真菌中，而在哺乳動物、魚類、鳥類、爬行動物以及昆蟲當中還沒有發(fā)現(xiàn)該途徑的存在，所以EPSP合成酶也被認為是一個潛在的新型

3、抗生素作用的靶位點。因此，針對草甘膦與該酶相互作用的機制，以及尋找與草甘膦有相同作用的其他化合物，科學家們作出了大量的研究，為進一步研究此類抗生素的設計打下了基礎。有報道指出缺乏了EPSP合成酶基因的病原菌不能正常存活，當然也不能導致疾病的產(chǎn)生。另外，有研究也證明了與莽草酸途徑中其他酶的相互作用也能夠產(chǎn)生抑菌的效果。 總之，EPSP合成酶在抗草甘膦農(nóng)作物以及新型抗生素的設計等方面都有著非常重要的應用價值。因此，對于酶性質(zhì)、催化機

4、制以及結(jié)構(gòu)和功能相互關系的研究對于EPSP合成酶的改造以及新型抗生素的設計都有著非常重要的意義。就酶的催化機制而言，在某些方面還存在著截然相反的觀點，例如“僅僅是S3P與酶的結(jié)合能否改變酶的構(gòu)象”。有的研究者通過實驗指出僅僅是S3P就能夠?qū)е旅笜?gòu)象的改變，而另一些研究者卻認為只有2個底物都結(jié)合在酶上，才能改變酶的構(gòu)象。因而對新發(fā)現(xiàn)的EPSP合成酶的研究將為此類爭議性問題提供全新的實驗證據(jù)。迄今為止，已經(jīng)從原核和真核生物中純化出了EPSP

5、合成酶，并且在多個生物中也克隆得到了編碼EPSP合成酶的基因(aroA基因)。鑒于還未見藻類EPSP合成酶基因的相關報道，本文就鹽藻的EPSP合成酶基因開展了一系列的研究，并取得了以下結(jié)果： 1)克隆了鹽藻EPSP合成酶的全長基因。 在實驗室前期的工作中，已經(jīng)通過構(gòu)建鹽藻cDNA文庫得到了一段鹽藻EPSP合成酶基因的EST序列。在該序列的基礎上,通過3’RACE和5’RACE的方法將EST序列向著3’和5’的方向分別延長

6、了約900 bp和1200 bp，經(jīng)拼接后得到了鹽藻EPSP合成酶基因的全長cDNA序列，其中3’末端達到了PolyA尾巴。該cDNA序列已提交到NCBI數(shù)據(jù)庫，GenBank的登陸號為EF051488。 2)通過生物信息學分析初步斷定克隆得到的cDNA序列屬于鹽藻EPSP合成酶基因。 經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)該cDNA編碼的最長氨基酸序列與其他物種的EPSP合成酶有著非常高的相似性；同時我們也預測出了在鹽藻EPSP合成酶的N端有一

7、段葉綠體轉(zhuǎn)運肽，這與植物的EPSP合成酶是一致的；系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)鹽藻EPSP合成酶與細菌EPSP合成酶的親緣關系要比高等植物接近一些；功能結(jié)構(gòu)域的預測結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白具有EPSP合成酶家族特有的模體；三級結(jié)構(gòu)的預測也顯示出鹽藻EPSP合成酶與大腸桿菌EPSP合成酶在結(jié)構(gòu)上非常一致。這些結(jié)果都表明我們克隆得到的cDNA確實屬于鹽藻EPSP合成酶基因。 3)構(gòu)建了鹽藻EPSP合成酶基因的原核表達體系和并純化了重組蛋白。 利用

8、表達載體pGEX-4T-1構(gòu)建了含鹽藻aroA基因的重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入到了大腸桿菌JM109中進行表達；通過表達條件優(yōu)化我們發(fā)現(xiàn)使用 0.03mmol/L的IPTG在30℃的條件下對重組蛋白進行誘導能夠最大程度的得到可溶性的EPSP合成酶；在此基礎上，利用GST親和層析柱我們純化出了融合表達的鹽藻EPSP合成酶；最后通過凝血酶的作用，將GST標簽蛋白除去，得到了正常大小的重組蛋白，為后續(xù)蛋白質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)相關的研究打下了基礎。

9、4)在大腸桿菌體內(nèi)鑒定了鹽藻EPSP合成酶基因的功能。 將含鹽藻aroA基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到了aroA基因缺失的大腸桿菌ER2799中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入的鹽藻aroA基因能夠互補ER2799中缺失掉的aroA基因的功能，維持大腸桿菌ER2799體內(nèi)芳香族氨基酸的合成，使其能夠在M9最低限度培養(yǎng)基上生長；草甘膦抗性實驗證明高表達的鹽藻EPSP合成酶能夠提高大腸桿菌對草甘膦的耐受性，并且可溶性蛋白的含量越高，大腸桿菌對草甘膦的耐受性越強

10、。這些都說明了我們克隆得到的鹽藻EPSP合成酶基因在大腸桿菌體內(nèi)是以有活性的形式存在的。 5)探討了底物結(jié)合對于酶構(gòu)象變化的影響。 利用熒光光譜，我們分析了鹽藻EPSP合成酶在結(jié)合底物后構(gòu)象的變化情況，為該領域存在的爭議問題提供了新的實驗證據(jù)。研究結(jié)果顯示僅僅是S3P的結(jié)合能導致酶熒光光譜微弱的改變，而酶在同時結(jié)合了S3P和PEP后，其熒光光譜變化加劇。因此我們認為僅僅是S3P的結(jié)合能夠使得酶結(jié)構(gòu)發(fā)生小范圍的變化，但還不

11、能形成“close”的構(gòu)象；只有當S3P和PEP都結(jié)合到了酶上后，酶才能發(fā)生劇烈的構(gòu)象變化，即從“open”構(gòu)象變成“close”構(gòu)象。除此而外，我們還發(fā)現(xiàn)，在添加了S3P和無機磷離子的EPSP合成酶中，酶的熒光光譜同樣發(fā)生了巨大的變化，這可能是因為無機磷離子能部分的占據(jù)PEP或者草甘膦在酶上的結(jié)合位點，從而與S3P一起改變酶的構(gòu)象。這解釋了部分研究者得到了“S3P-酶”二元復合物晶體為什么以“close”構(gòu)象存在。 6)培育了

12、草甘膦抗性鹽藻株并分析了其產(chǎn)生耐受性的原因。通過此部分實驗我們希望獲得突變的有草甘膦耐受性的鹽藻EPSP合成酶，進而發(fā)現(xiàn)一些與草甘膦耐受性相關的氨基酸殘基。通過向鹽藻培養(yǎng)基中不斷的加入并提高草甘膦選擇壓，逐步培養(yǎng)出了能夠在不同草甘膦濃度下生長的鹽藻，但是通過比較草甘膦耐受性鹽藻與正常鹽藻體內(nèi)的EPSP合成酶的氨基酸序列，并沒有發(fā)現(xiàn)任何位點的氨基酸突變。于是，利用實時熒光定量PCR測定了不同草甘膦濃度的抗性鹽藻體內(nèi)EPSP合成酶的表達差異

13、，結(jié)果顯示2.0mmol/L草甘膦抗性的鹽藻體內(nèi)EPSP合成酶mRNA的表達量是正常鹽藻的12倍。因此我們認為所培養(yǎng)的鹽藻能對草甘膦產(chǎn)生耐受性的原因是其體內(nèi)EPSP合成酶的高效表達；進一步的實驗證實了鹽藻需要一個及其緩慢的過程來高效表達自身的EPSP合成酶，以適應高草甘膦濃度的外界環(huán)境。 綜上，我們首次從鹽藻中分離得到了EPSP合成酶的編碼基因；通過原核表達純化了重組蛋白，并鑒定了該基因的功能；研究了底物結(jié)合后鹽藻EPSP合成酶