鹽生杜氏藻具有獨(dú)特雙結(jié)構(gòu)域3-磷酸甘油脫氫酶的功能鑒定.pdf

1、鹽生杜氏藻Dunaliellesalina(簡稱鹽藻)是迄今為止世界上發(fā)現(xiàn)的最耐鹽的真核光合生物，而甘油是鹽藻用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓變化的關(guān)鍵調(diào)滲物質(zhì)。依賴NAD+輔酶的3-磷酸甘油脫氫酶(GPD，ECl.1.1.8)是鹽藻甘油代謝途徑中的關(guān)鍵酶。因此，對(duì)該基因的功能研究在植物抗逆性和甘油工程菌的構(gòu)建方面都將發(fā)揮極其重要的作用。本文預(yù)測，鹽藻Osm-GPD可能同時(shí)具有3-磷酸甘油脫氫酶(GPD)與3-磷酸甘油磷酸化酶(GPD)雙活性，且

2、這一特點(diǎn)與鹽藻極其耐鹽的特性相關(guān)。為證實(shí)提出的預(yù)測，本文從基因和蛋白水平上分別對(duì)鹽藻Osm-GPD特殊基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行功能研究?！　〉谝?，成功建立鹽藻GPD和GPP的活性測定方法，比較不同鹽濃度下兩者活性變化的差異?！　〉诙趍RNA水平上研究Osm-GPD基因在鹽藻中的表達(dá)的情況?！　〉谌?，鹽藻Osm-GPD基因不同結(jié)構(gòu)域基因片段的克隆?！　〉谒?，gpd1.1和gpd1.9基因片段的原核表達(dá)及純化。構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體pET-G

3、PD1.1和pET-GPD1.9，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中表達(dá)，通過Ni親和層析進(jìn)行一步純化?！　〉谖?，鹽藻Osm-GPD天然蛋白的westernbloting分析。利用GPD1.1和GPD1.9重組蛋白分別制備兩者的多克隆抗體，再對(duì)鹽藻天然蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。　　第六，通過功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)驗(yàn)證GPD1.1和GPD1.9的功能。構(gòu)建釀酒酵母表達(dá)載體pRS-GPD1.1和pRS-GPD1.9，通過電轉(zhuǎn)化分別轉(zhuǎn)入缺陷GPD1的釀酒酵