鹽生杜氏藻線粒體3-磷酸甘油脫氫酶基因的克隆、表達以及功能鑒定.pdf

1、線粒體3-磷酸甘油脫氫酶(FAD-GPDH)是由核基因編碼的蛋白，位于線粒體內膜的外表面，催化位點朝向細胞質，以3-磷酸甘油為底物，并通過其輔基FAD與呼吸鏈相連。它與細胞質3-磷酸甘油脫氫酶(NAD<'+>-GPDH)一起組成3-磷酸甘油穿梭(glycerol-3-phosphate shuttle)，在該穿梭中，細胞質3-磷酸甘油脫氫酶把NADH氧化成NAD<'+>，同時還原糖酵解途徑的中間代謝物——磷酸二羥基丙酮為3-磷酸甘油；隨

2、后，3-磷酸甘油穿過線粒體外膜，在內膜的外表面被線粒體3-磷酸甘油脫氫酶重新氧化成磷酸二羥基丙酮，脫下的兩個電子由線粒體3-磷酸甘油脫氫酶的輔基：FAD傳給輔酶O，進入呼吸鏈傳遞，產(chǎn)生能量以供細胞的生長代謝需要。氧化生成的磷酸二羥基丙酮重新回到細胞質，進行下一輪循環(huán)或回到糖酵解途徑。因此，3-磷酸甘油穿梭的實質就是把細胞質中NADH上的電子傳到呼吸鏈，從而維持細胞質的氧化還原平衡。 3-磷酸甘油穿梭普遍存在于真核生物中。在酵母和

3、動物中3-磷酸甘油穿梭早有報道，且已有較深入的研究；但是直到最近才在擬南芥中發(fā)現(xiàn)線粒體3-磷酸甘油脫氫酶，并通過進一步實驗證明植物中也存在3-磷酸甘油穿梭，除此之外再沒有其它關于植物3-磷酸甘油穿梭的報道；至今未見任何有關藻類3-磷酸甘油穿梭的報道。 鹽生杜氏藻(Dunaliella salina，鹽藻)是一種單細胞綠藻，能在很大鹽濃度范圍內生長，沒有細胞壁，通過細胞膜伸縮改變細胞體積和調整細胞中的甘油濃度來適應不同的滲透環(huán)境。

4、線粒體3-磷酸甘油脫氫酶的底物——3-磷酸甘油，既是甘油合成的前體，同時也是合成細胞中甘油脂(包括膜脂和貯藏脂)必不可少的前體物質，所以研究鹽藻細胞中3．磷酸甘油的代謝有利于更好地了解鹽藻適應高滲環(huán)境的內在機制。因為生物體細胞在脅迫條件下，往往會導致細胞內NADH/NAD<'+>比例的失衡，即氧化還原狀態(tài)的失衡，所以對鹽藻線粒體3-磷酸甘油脫氫酶的功能和特性進行研究，可以為進一步窺探鹽藻細胞的3-磷酸甘油穿梭及其在調節(jié)細胞中氧化還原平衡

5、所發(fā)揮的作用奠定基礎。本論文的內容包括鹽藻線粒體3-磷酸甘油脫氫酶全長cDNA的克隆、對編碼框蛋白質序列進行生物信息學分析、進行原核表達及體外功能鑒定、在轉錄和酶活水平上進行表達分析。取得成果具體如下： 1、克隆了鹽藻線粒體3-磷酸甘油脫氫酶基因全長cDNA：在鹽藻cDNA文庫中篩選獲得線粒體3-磷酸甘油脫氫酶基因EST序列的基礎上，進行3’RACE和5’RACE，獲得了包括編碼框序列、3’端非編碼區(qū)及5’端非編碼區(qū)的線粒體3-

6、磷酸甘油脫氫酶基因全長cDNA序列。 2、完成鹽藻線粒體3-磷酸甘油脫氫酶基因編碼框蛋白質序列的生物信息學分析：信號肽分析發(fā)現(xiàn)其N端具有導向線粒體的前導肽序列；跨膜結構分析發(fā)現(xiàn)氨基酸序列中有3個明顯的跨膜結構域；把它與其它物種的線粒體3-磷酸甘油脫氫酶進行多序列比對發(fā)現(xiàn)，在保守區(qū)域具有FAD結合位點和3-磷酸甘油結合位點。 3、進行鹽藻線粒體3-磷酸甘油脫氫酶基因的原核表達及體外酶活測定：把鹽藻線粒體3-磷酸甘油脫氫酶基