炎癥狀態(tài)下GR對(duì)豬TLR2、4表達(dá)的調(diào)控.pdf

1、天然免疫，作為機(jī)體抵抗病原入侵的第一道防線，可在病原感染之初迅速調(diào)動(dòng)機(jī)體防御系統(tǒng)。天然免疫這種強(qiáng)大功能的激活，主要依靠Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)對(duì)病原進(jìn)行識(shí)別，繼而激活補(bǔ)體系統(tǒng)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子、化學(xué)增活素等天然免疫效應(yīng)分子的分泌，調(diào)動(dòng)NK細(xì)胞和吞噬細(xì)胞，從而對(duì)病原進(jìn)行應(yīng)答。病原入侵也可激活HPA軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)對(duì)天然免疫進(jìn)行調(diào)控。糖皮質(zhì)激素受體（

2、Glucocorticoid receptor，GR）作為應(yīng)激反應(yīng)的效應(yīng)器，可以對(duì)TLR信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控。許多研究表明，GR可以在轉(zhuǎn)錄水平上以“蛋白-基因”、“蛋白-蛋白”等模式，對(duì)TLR所介導(dǎo)的信號(hào)分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控從而抑制炎癥反應(yīng)。盡管如此，GR作為轉(zhuǎn)錄因子，直接對(duì)TLR進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究較少。
　　眾所周知，病原感染以及疫苗免疫會(huì)激發(fā)機(jī)體對(duì)病原產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。盡管如此，豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumo

3、niae）感染后GR是否直接對(duì)豬肺臟TLR2進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以及疫苗免疫是否對(duì)此產(chǎn)生干擾作用，目前還不清楚。另一方面，現(xiàn)代養(yǎng)殖場(chǎng)的很多管理方式都會(huì)誘使家畜產(chǎn)生應(yīng)激。許多研究采用ACTH長(zhǎng)時(shí)間處理動(dòng)物來(lái)模擬慢性應(yīng)激反應(yīng)，而使用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）處理動(dòng)物可模擬病原菌感染所誘導(dǎo)的急性炎性反應(yīng)。ACTH預(yù)處理所模擬的慢性應(yīng)激，是否會(huì)通過(guò)影響TLRs/GR的交互作用干擾LPS在豬組織局部誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，目前尚不清楚

4、。
　　本課題在豬肺炎支原體感染動(dòng)物模型以及LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)動(dòng)物模型中，研究了GR對(duì)TLR2/4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，以及疫苗免疫或ACTH預(yù)處理對(duì)這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。本論文分為三大主要部分。
　　1.豬肺炎支原體感染狀態(tài)下豬肺臟GR對(duì)TLR2的調(diào)控以及疫苗免疫的影響
　　本試驗(yàn)從5窩豬群（約克×梅山）中選取15頭15d仔豬（每窩3頭），并將其隨機(jī)分為三組，分別為對(duì)照組(CC);未免疫感染組(NI);免疫感染組豬(VI)

5、。VI組豬通過(guò)頸部肌肉注射1 mL豬肺炎支原體疫苗，其它兩組豬（CC和NI組）以相同的方式模擬注射等量PBS。一個(gè)月后，VI和NI組豬經(jīng)氣管注射2 mL攻毒株(109CCU/mL)，而CC豬以相同的方式模擬注射等量PBS。研究結(jié)果顯示，NI組豬出現(xiàn)支原體感染的典型肺炎病理?yè)p傷，肺損傷評(píng)分顯著高于VI組（P＜0.05），疫苗免疫可以顯著緩解豬肺炎支原體感染引起的臨床癥狀以及肉眼可見(jiàn)的肺臟損傷，而對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和肺臟病理變化。

6、盡管如此，NI和VI組豬肺臟支原體DNA的含量分別為104.14 copies/mL和103.67 copies/mL，均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），疫苗免疫沒(méi)有改變肺臟豬肺炎支原體DNA含量。NI組以及VI組豬血清皮質(zhì)醇水平分別為52.2 ng/mL和33.8 ng/mL，均極顯著低于CC組（CC組為76.8 ng/mL;P＜0.01），但只有VI組GR在核內(nèi)的表達(dá)顯著低于CC組（P＜0.05）。TLRs1～10均在豬肺臟中有表

7、達(dá)，其中TLR2的表達(dá)量最高。NI組豬TLR2 mRNA的表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，而VI組無(wú)明顯的變化。使用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，發(fā)現(xiàn)NI組豬GR與TLR2啟動(dòng)子的結(jié)合上調(diào)（P＜0.05），但VI組豬呈下調(diào)趨勢(shì)。這表明豬肺炎支原體疫苗免疫，可能通過(guò)抑制GR核轉(zhuǎn)移以及GR與TLR2啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制肺TLR2的基因轉(zhuǎn)錄。
　　2.LPS處理狀態(tài)下GR對(duì)豬肺臟TLR表達(dá)的調(diào)控以及慢性應(yīng)激的影響
　　24頭三元雜交（杜洛克×

8、長(zhǎng)白×大白）雄性仔豬，平均體重為12±0.5 kg，隨機(jī)分為4個(gè)處理組，每組6頭豬，分別為空白對(duì)照組(CC);無(wú)ACTH預(yù)處理的LPS注射組(LPS);ACTH單獨(dú)注射組(ACTH);有ACTH預(yù)處理的LPS注射組(ACTH+LPS)。ACTH以及ACTH+LPS組豬連續(xù)兩天肌肉注射ACTH（2.25 IU/kg體重），每隔6小時(shí)注射一次，共注射7次，其余兩組在相同時(shí)間點(diǎn)等體積注射生理鹽水。最后一次ACTH注射后6h，向LPS組以及AC

9、TH+LPS組豬肌肉注射LPS（15μg/kg體重），其余兩組以相同方式注射等體積生理鹽水。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)ACTH預(yù)處理時(shí)LPS顯著上調(diào)了血清腫瘤壞死因子（TNF）-α以及肺臟IL-1β mRNA、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)水平(P＜0.05)，但對(duì)肺臟白細(xì)胞介素(IL)-6、TNF-α以及環(huán)氧合酶(COX)-2mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響;ACTH預(yù)處理對(duì)LPS所誘導(dǎo)的肺臟炎癥因子的表達(dá)無(wú)顯著影響;ACTH單獨(dú)處理對(duì)這些促炎因

10、子的表達(dá)無(wú)顯著影響。無(wú)ACTH預(yù)處理時(shí)LPS顯著下調(diào)了肺臟皮質(zhì)醇水平（P＜0.05）;ACTH預(yù)處理對(duì)LPS的處理效果無(wú)顯著作用;與對(duì)照組相比，ACTH單獨(dú)處理引起皮質(zhì)醇的水平下調(diào)（P＜0.05）。無(wú)ACTH預(yù)處理時(shí)LPS顯著上調(diào)了TLR2 mRNA表達(dá)(P＜0.05);ACTH預(yù)處理對(duì)LPS的處理效果無(wú)顯著影響。無(wú)ACTH預(yù)處理時(shí)LPS有下調(diào)總GR表達(dá)的趨勢(shì)(P=0.089);ACTH預(yù)處理對(duì)LPS的處理效果無(wú)顯著作用;與對(duì)照組相比，

11、ACTH單獨(dú)處理也可顯著下調(diào)GR總蛋白的表達(dá)(P=0.041)。LPS處理未影響GR對(duì)TLR2、4基因啟動(dòng)子的結(jié)合，ACTH對(duì)此無(wú)顯著作用。這些結(jié)果說(shuō)明，LPS可能通過(guò)激活TLR2基因轉(zhuǎn)錄，以及抑制GC以及總GR蛋白的表達(dá)，從而引起肺臟發(fā)生輕微的炎癥反應(yīng)，在此過(guò)程中，LPS并沒(méi)有影響GR與TLR2啟動(dòng)子的結(jié)合。ACTH預(yù)處理所模擬的慢性應(yīng)激對(duì)LPS在肺臟的促炎作用無(wú)顯著影響。
　　3.LPS處理狀態(tài)下GR對(duì)豬腎上腺TLR表達(dá)的調(diào)控

12、以及慢性應(yīng)激的影響
　　腎上腺幫助機(jī)體維持最佳的生理和免疫功能，它不僅是機(jī)體應(yīng)激系統(tǒng)的終末器官，還具有在急、慢性應(yīng)激反應(yīng)時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能，從而提高宿主對(duì)病原入侵的抵抗能力。鑒于腎上腺在機(jī)體抵御應(yīng)激反應(yīng)中的重要性，本試驗(yàn)繼續(xù)探討ACTH處理是否會(huì)通過(guò)TLRs/GR的交互作用，干擾LPS在腎上腺刺激的炎癥反應(yīng)。本試驗(yàn)的動(dòng)物處理同上述第二部分試驗(yàn)。LPS單獨(dú)刺激可使腎上腺細(xì)胞線粒體亞結(jié)構(gòu)發(fā)生代償性損傷，ACTH預(yù)處理可以明顯緩解

13、LPS對(duì)線粒體的損傷。無(wú)ACTH預(yù)處理時(shí)，LPS可引起IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、COX-2 mRNA表達(dá)的上調(diào)（P＜0.05）;ACTH預(yù)處理對(duì)LPS的誘導(dǎo)效果無(wú)顯著作用。無(wú)ACTH預(yù)處理時(shí)，LPS有上調(diào)IL-6蛋白表達(dá)的趨勢(shì)(P=0.065);有ACTH預(yù)處理時(shí)，可顯著抑制LPS的誘導(dǎo)作用(P＜0.05)，下調(diào)IL-6蛋白的表達(dá)。無(wú)ACTH預(yù)處理時(shí)，LPS處理2h會(huì)極顯著上調(diào)血清皮質(zhì)醇水平(P＜0.01);ACTH

14、預(yù)處理會(huì)顯著緩解LPS的作用，使LPS處理6h后腎上腺以及血清中的皮質(zhì)醇恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。無(wú)ACTH預(yù)處理時(shí)，LPS處理可顯著下調(diào)T-SOD活性（P＜0.05）;ACTH預(yù)處理對(duì)LPS的處理效果無(wú)顯著作用。LPS處理僅對(duì)iNOS活性存在主效應(yīng)，具有顯著的上調(diào)作用(P=0.048)。LPS處理分別極顯著和顯著地促進(jìn)TLR2和TLR4 mRNA的表達(dá)（P＜0.01或P＜0.05），但對(duì)TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)卻無(wú)顯著作用;ACTH預(yù)處理對(duì)

15、LPS的處理效果有顯著影響，可顯著下調(diào)TLR2mRNA的表達(dá)（P＜0.05），并有下調(diào)TLR4 mRNA表達(dá)的趨勢(shì)(P=0.067)。在無(wú)ACTH預(yù)處理時(shí)，LPS處理會(huì)使腎上腺GR mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）;ACTH預(yù)處理，對(duì)LPS的處理效果無(wú)顯著作用。LPS極顯著降低以TLR4基因?yàn)榘械膕sc-miR-338表達(dá)（P＜0.01），但對(duì)ssc-miR-146b表達(dá)無(wú)顯著影響;與對(duì)照組相比，ACTH預(yù)處理可與LPS共同促進(jìn)ss

16、c-miR-146b表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。LPS可顯著降低GR對(duì)TLR4基因啟動(dòng)子GRE的結(jié)合(P＜0.05)。單純ACTH處理，對(duì)炎癥因子的釋放，皮質(zhì)醇水平，氧化應(yīng)激反應(yīng)，TLR2、TLR4以及GR基因的轉(zhuǎn)錄，ssc-miR-146b表達(dá)都無(wú)顯著影響。這說(shuō)明，LPS可能通過(guò)抑制GR與TLR4啟動(dòng)子的結(jié)合，從而直接激活TLR4基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腎上腺細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而刺激皮質(zhì)醇的分泌。ACTH預(yù)處理后，TLR2、TLR4基因的轉(zhuǎn)錄水