肺炎鏈球菌肺炎小鼠TLR2、TLR4表達及免疫調(diào)節(jié)研究.pdf

1、目的:
　　了解肺炎鏈球菌肺炎小鼠TLR2、TLR4、 hBD2、IL-8及TNF-α的表達，探索地塞米松和細菌溶解產(chǎn)物對TLR2、TLR4、hBD2、IL-8及TNF-α的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　方法:
　　1.購上海斯萊克實驗動物有限公司150只6-8周SPF級C57BL/6小鼠，體重18-23克，每組30只，雌雄各半。隨機分成5組，分別為對照組(NS組)、感染組(SP組)、感染+細菌溶解產(chǎn)物組（SB組）、感染+地塞米

2、松組（SD組）、感染+細菌溶解產(chǎn)物+地塞米松（SDB組）。在感染Spn前，SB組和SDB組灌胃0.4ml(1.75mg細菌溶解產(chǎn)物)混懸液，每日1次，連續(xù)10天;另外3組灌胃0.4ml生理鹽水，每日1次，連續(xù)10天。SP肺炎小鼠為麻醉后采用滴鼻法接種50ul(4.0×108CFU/ml)肺炎鏈球菌懸液，對照組小鼠滴鼻接種50ul無菌生理鹽水;從感染后第1天開始SD組和SDB組腹腔注射0.1ml(含0.1mg)地塞米松，每天1次;另外3組

3、同一時間腹腔注射0.1ml生理鹽水，每日1次。所有組分為感染3天、8天亞組。
　　2.所有小鼠，分別于感染后3天、8天處死，眼球取血，分離肺組織。并進行下述研究:①觀察小鼠一般情況并記錄體重變化。②取左肺下葉固定做石蠟病理切片、肺臟器系數(shù)比較，并對BALF行細胞分類計數(shù)。③免疫組化法測定小鼠肺組織中TLR2、TLR4蛋白的表達。④采用Real-time RT-PCR法測定小鼠肺組織中hBD2、IL-8 mRNA的表達水平。⑤ELI

4、SA法檢測BALF、血清中細胞因子(IL-8、TNF-α)表達水平。
　　3.采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的錄入和分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，正確選擇方差分析、t檢驗等統(tǒng)計方法。P＜0.05為差異具有顯著性意義。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠一般情況:NS組小鼠體形適中，警覺性高，歡快活躍，反應靈敏，毛發(fā)光澤，體重呈上升趨勢;SP組、SB組小鼠滴鼻肺炎鏈球菌后，出現(xiàn)反應遲鈍，警覺性差，毛發(fā)晦暗，體重下降等表

5、現(xiàn); SD組、SDB組小鼠總體反應一般，毛發(fā)欠光滑，體重下降不明顯。SP組30只中8只小鼠死亡，死亡率27.6％; SB組30只中4只小鼠死亡，死亡率13.3％; SDB組死亡3只，死亡率10％，SD組、NS組無小鼠死亡。
　　2.體重變化:分別比較3天和8天亞組的不同組別小鼠體重(F=17.77，P＜0.01和F=19.07，P＜0.01)。在3天時間點，SP組與NS組比較，體重有明顯下降（*P＜0.05），SD組高于SP組（＃

6、＃P＜0.01），SDB組高于SP組（＃P＜0.05）;在8天時間點上，SP組低于NS組（**P＜0.01），SD組、SDB組高于SP組（＃＃P＜0.01），具有統(tǒng)計學意義。
　　3.無菌操作，抽取BALF后細菌培養(yǎng)出肺炎鏈球菌。肺部病理表現(xiàn):SP組小鼠肺毛細血管壁擴張、充血，肺泡腔內(nèi)有大量紅細胞及炎性細胞浸潤，并出現(xiàn)大量纖維素滲出，說明造模成功。
　　4.肺臟系數(shù)比較:分別比較3天和8天亞組的不同組別小鼠肺臟系數(shù)(F=14

7、.07，P＜0.01和F=23.45，P＜0.01)。SP組小鼠肺臟系數(shù)明顯增大，表示臟器充血、水腫。在3天時間點，SP組肺臟系數(shù)高于NS組（**P＜0.01），SB組、SD組、SDB組均低于SP組（均為＃＃P＜0.01），SD組低于SB組(△P＜0.05);在8天時間點上，SP組高于NS組（**P＜0.01），SB組、SDB組低于SP組（＃P＜0.05），SD組肺臟系數(shù)低于SP組（＃＃P＜0.01）。
　　5.各組小鼠BALF白

8、細胞總數(shù)和分類計數(shù)結(jié)果顯示:NS組小鼠BALF中主要以巨噬細胞為主，其他各組均為中性粒細胞為主。在感染肺炎鏈球菌后第3天，各組BALF中總細胞數(shù)顯著升高，尤以SP、SB組明顯;隨著時間延長，細胞總數(shù)及中性粒細胞計數(shù)均回落，但仍較NS組有升高。白細胞計數(shù)方面:分別比較3天和8天亞組的不同組別（F=30.52，P＜0.01和F=8.69，P＜0.05）。3天和8天亞組，SP組均高于NS組（均為**P＜0.01），SD組、SDB組均較SP組低

9、（同為＃＃P＜0.01），SD組、SDB組分別低于SB組(△△P＜0.01)。中性粒細胞方面:分別比較3天和8天亞組的不同組別（F=21.59，P＜0.01和F=19.36，P＜0.01）。3天組，SP組中性粒細胞計數(shù)高于NS組比較(**P＜0.01)，SD組、SDB組低于SP組（＃＃P＜0.01），SD組、SDB組分別低于SB組(△△P＜0.01)。8天組，SP組高于NS組（**P＜0.01），SB組、SD組、SDB組低于SP組(＃＃

10、P＜0.01)，SDB組低于SB組(△P＜0.05)。
　　6.TLR2蛋白陽性細胞主要分布于呼吸道上皮細胞、肺泡上皮細胞、巨噬細胞。在肺炎鏈球菌感染早期SP組陽性細胞顆粒數(shù)目明顯增多。分別比較3天和8天亞組的不同組別TLR2蛋白的IOD值（F=36.46，P＜0.01和F=25.08，P＜0.01）。3天組，SP組高于NS組（**P＜0.01），SD組、SDB組分別高于SP組比較（＃＃P＜0.01），SD組高于SB組比較(△△P

11、＜0.01)，SDB組高于SB組(△P＜0.05)。8天組，SP組高于NS組（*P＞0.05），其余各組兩兩比較均無統(tǒng)計學意義。TLR4蛋白陽性細胞散在分布于呼吸道上皮細胞、肺泡上皮細胞。肺炎鏈球菌感染后SP組陽性細胞顆粒數(shù)目略有增多。分別比較3天和8天亞組的不同組別TLR4蛋白的IOD值（F=10.74，P＜0.05和F=2.87，P＞0.05）。3天組，SP組高于NS組（**P＜0.01），其余各組兩兩比較均無統(tǒng)計學意義。8天組各組

12、兩兩比較均無統(tǒng)計學意義。
　　7.肺組織hBD2 mRNA、IL-8 mRNA均在NS組△Ct值最高，說明含量最低;SP組△Ct值最低，說明含量最高。hBD2 mRNA的表達:分別比較3天和8天亞組的不同組別(F=15.51，P＜0.01和F=8.61，P＜0.05)。3天組，SP組高于NS組（**P＜0.01），SD組、SDB組低于SP組比較(＃＃P＜0.01)，SD組、SDB組分別低于SB組比較(△△P＜0.01)。8天組，S

13、P組高于NS組（**P＜0.01），SD組、SDB組低于SP組比較（＃＃P＜0.01），SD組、SDB組低于SB組(△△P＜0.01)。IL-8 mRNA的表達:分別比較3天和8天亞組的不同組別(F=21.37，P＜0.01和F=16.78， P＜0.01)。3天組、8天組的統(tǒng)計學與hBD2 mRNA變化一致。8.BALF中IL-8、TNF-α含量在SP組均明顯升高。BALF中IL-8的水平:分別比較3天和8天亞組的不同組別(F=20.

14、38，P＜0.01和F=7.48，P＜0.05)。3天組，SP組高于NS組（**P＜0.01），SD組、SDB組低于SP組比較（＃＃P＜0.01），SD組、SDB組分別與SB組比較(△△P＜0.01)。8天組，SP組高于NS組（**P＜0.01），SB組低于SP組(＃P＜0.05)，SD組、SDB組低于SP組（同為＃＃P＜0.01），SD組、SDB組低于SB組比較(△△P＜0.01)。
　　BALF中TNF-α的水平:分別比較3天

15、和8天亞組的不同組別(F=22.36，P＜0.01和F=11.79， P＜0.05)。3天組與8天組相同，SP組高于NS組（**P＜0.01），SD組、SDB組低于SP組比較(＃＃P＜0.01)，SD組、SDB組低于SB組(△△P＜0.01)。9.血清中IL-8、TNF-α含量在SP組均顯著升高。血清中IL-8的表達:分別比較3天和8天亞組的不同組別（F=31.41， P＜0.01和F=19.43， P＜0.01）。3天組和8天組變化相

16、同，SP組高于NS組（**P＜0.01），SD組、SDB組分別低于SP組比較（＃＃P＜0.01），SD組、SDB組分別低于SB組比較(△△P＜0.01)，余兩兩比較無統(tǒng)計學意義。血清中TNF-α的表達:分別比較3天和8天亞組的不同組別(F=23.07， P＜0.01和F=11.42， P＜0.05)。3天組，SP組高于NS組比較（**P＜0.01），SD組、SDB組分別低于SP組（＃＃P＜0.01），SD組、SDB組低于SB組比較(△△

17、P＜0.01)，余兩兩比較無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:
　　1.肺炎鏈球菌肺炎小鼠有TLR2、TLR4表達上調(diào)，提示天然免疫參與肺炎鏈球菌肺炎的免疫應答。
　　2.地塞米松可上調(diào)TLR2的表達，而細菌溶解產(chǎn)物組小鼠較肺炎鏈球菌組無顯著性差異;細菌溶解產(chǎn)物和地塞米松對TLR4表達無明顯影響。
　　3.hBD2、IL-8和TNF-α與肺炎鏈球菌感染有關。地塞米松可下調(diào)hBD2、IL-8和TNF-α表達。細菌溶解產(chǎn)物組小