鎘耐受性BEAS-2B細(xì)胞中鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)變化以及非同義性ZIP8(SLC39A8)的功能研究.pdf

1、背景：ZIP8(SLC39A8)是一種轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)金屬離子的膜蛋白，屬于鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的一員，把金屬離子從細(xì)胞外周或者細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)內(nèi)。ZIP8能轉(zhuǎn)運(yùn)人體所必需的多種金屬元素如鋅、鐵、錳等，它所介導(dǎo)的鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)能夠激活免疫 T細(xì)胞、調(diào)節(jié)先天性免疫系統(tǒng)、以及促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎的病變。另外，ZIP8對(duì)重金屬元素鎘也有很強(qiáng)的結(jié)合能力，它在睪丸血管內(nèi)皮細(xì)胞中的特異性表達(dá)導(dǎo)致小鼠對(duì)鎘的敏感性提高。在帶有三個(gè)SLC39A8拷貝的轉(zhuǎn)基因小鼠中，也發(fā)現(xiàn)

2、鎘誘導(dǎo)的睪丸壞死和腎衰竭比在正常小鼠身上更為嚴(yán)重。在多種鎘耐受細(xì)胞，包括本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證明的大鼠肺上皮細(xì)胞（rat lung epithelial cell，rLEC）中，ZIP8的表達(dá)量相比其他金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都顯著下降，表明ZIP8可能是鎘進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的主要途徑之一。
　　近年來(lái)，多個(gè)基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS, genome-wide association study）表明位于SLC39A8編碼區(qū)上的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性突變（s

3、ingle nucleotide polymorphism,SNP）與多種復(fù)雜疾病如高血壓，肥胖以及精神分裂癥有關(guān)聯(lián)。該SNP(rs13107325)，是非同義性的，把ZIP8蛋白391位點(diǎn)上原來(lái)的丙氨酸(alanine,A)突變成蘇氨酸(threonine,T)，目前還不清楚該突變是否會(huì)影響ZIP8的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)能力。
　　目的：
　　1.探究在鎘耐受性人肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B中鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的表達(dá)變化。
　

4、　2.制作出效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗人ZIP8的抗體用于ZIP8蛋白的檢測(cè)。
　　3.探究ZIP8蛋白A391位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性突變(rs13107325)是否以及如何影響其功能。
　　方法：
　　1.利用半定量PCR篩選鋅離子轉(zhuǎn)入蛋白家族ZIP/SLC39A和轉(zhuǎn)出蛋白家族ZnT/SLC30A在鎘耐受性和鎘敏感性BEAS-2B細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平。
　　2.在大腸桿菌中誘導(dǎo)并純化包含ZIP8肽段的GST融合蛋白

5、。
　　3.以背部皮下和耳緣靜脈注射的方式，將包含ZIP8肽段的GST融合蛋白作為抗原免疫新西蘭白兔。
　　4.利用ELISA、Western blot和免疫熒光染色檢測(cè)ZIP8抗血清的效價(jià)和特異性。
　　5.通過(guò)Western blot和免疫熒光染色檢測(cè)ZIP8在鎘耐受性和鎘敏感性BEAS-2B細(xì)胞中的表達(dá)水平。
　　6.采用點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建表達(dá)ZIP8 A391T和ZIP8 A391E突變體的載體，利用Gene

6、ctin在HeLa細(xì)胞中篩選表達(dá)ZIP8 wild type、ZIP8 A391T以及ZIP8 A391E的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。
　　7.通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞存活率（NBB染色）和細(xì)胞內(nèi)鋅離子的水平（原子吸收光譜）研究ZIP8 A391上的單核苷酸多態(tài)性突變(rs13107325)對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.在所有ZIP和ZnT家族中，ZIP8的mRNA水平在鎘耐受性BEAS-2B細(xì)胞中，相對(duì)于鎘敏感性細(xì)胞，

7、下降地最為顯著；ZnT1的mRNA水平則增加的最為顯著。
　　2.在注射了ZIP8抗原的新西蘭白兔中，我們分離并純化出的抗ZIP8血清能夠用于Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)。
　　3.使用本實(shí)驗(yàn)室制作的抗ZIP8血清來(lái)檢測(cè)其蛋白水平變化，發(fā)現(xiàn)ZIP8在鎘耐受性BEAS-2B細(xì)胞中的表達(dá)顯著下降。
　　4.通過(guò)NBB染色檢測(cè)細(xì)胞生存率，我們發(fā)現(xiàn)ZIP8 A391T細(xì)胞系，細(xì)胞生存率顯著高于ZIP8 WT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)

8、胞系。通過(guò)原子吸收光譜檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的水平，發(fā)現(xiàn)ZIP8 A391T細(xì)胞，相對(duì)ZIP8 WT，細(xì)胞內(nèi)鋅離子的水平有所降低。
　　結(jié)論：
　　1.IP8的表達(dá)水平下降和ZnT1表達(dá)水平的升高很可能是 BEAS-2B細(xì)胞產(chǎn)生鎘耐受性的原因。
　　2.我們制作的抗ZIP8血清效價(jià)高、特異性強(qiáng)，為以后進(jìn)一步研究ZIP8的生物功能奠定了基礎(chǔ)。
　　3.ZIP8 A391位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性突變(rs13107325)極有