捻轉(zhuǎn)血矛線蟲六種酶蛋白體外對山羊外周血單個核細(xì)胞功能的影響.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）是毛圓科(Trichostrongylidae)血矛屬（Haemonchus）線蟲，是嚴(yán)重危害牛羊等反芻動物的一種重要寄生蟲，蟲體主要寄生于宿主第四胃，偶見于小腸，以吸食宿主血液為營養(yǎng)來源。目前，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病雖然在免疫學(xué)研究上有了重要的進(jìn)展，但至今仍無商品化的疫苗出現(xiàn)，所以發(fā)掘新的抗原、進(jìn)一步研究蟲體抗原的特性對于疫苗的開發(fā)尤為重要。本文對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的谷胱甘肽過氧化物酶(glu

2、tathione peroxidase，HC29)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、谷氨酸脫氫酶(glutamatedehydrogenase，GDH)、烯醇化酶(enolase，ENO)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphateisomerase，TPI)及醛縮酶(aldolase，ALD)進(jìn)行了重組表達(dá)，進(jìn)而研究這六種重組酶蛋白體外與山羊外

3、周血單個核細(xì)胞的結(jié)合情況;對外周血單個核細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)和增殖的影響以及對巨噬細(xì)胞吞噬功能和分泌NO的影響。
　　1捻轉(zhuǎn)血矛線蟲六種酶蛋白的表達(dá)及體外與山羊外周血單個核細(xì)胞的結(jié)合試驗(yàn)
　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)并純化六種重組酶蛋白。無菌采集山羊頸靜脈的抗凝血，分離外周血單個核細(xì)胞，將重組蛋白以5μg/mL的濃度加入細(xì)胞中，放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2小時后收集細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光抗體技術(shù)檢測到重組蛋白谷胱甘肽過氧化物酶和甘油醛-3-磷

4、酸脫氫酶能夠在體外與山羊外周血單個核細(xì)胞結(jié)合，其余蛋白未檢測出這一特點(diǎn)。
　　2捻轉(zhuǎn)血矛線蟲六種酶蛋白對山羊外周血單個核細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　根據(jù)GenBank中山羊IL-2、IL-4、IL-I0、IL-17、IFN-γ和TGF-β的序列設(shè)計(jì)符合熒光定量試驗(yàn)的引物。以β-Actin為內(nèi)參，用HC29、GAPDH、ENO、ALD、TPI和GDH重組蛋白按濃度梯度分別刺激外周血單個核細(xì)胞后得到的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量試

5、驗(yàn)，檢測不同重組蛋白不同濃度刺激后細(xì)胞因子的變化情況。結(jié)果顯示，在重組蛋白HC29組中，IL-10和IFN-γ的表達(dá)量在三個濃度梯度（10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL）下均顯著高于對照組(P＜0.01);GAPDH組中，IL-2、IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ在高濃度40μ g/mL下均顯著高于對照組(P＜0.01);其余四種重組蛋白組中各個細(xì)胞因子的變化不明顯(P＞0.05)。
　　3捻轉(zhuǎn)血矛線蟲六種

6、酶蛋白對山羊外周血單個核細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響
　　為了檢測這六種重組蛋白對山羊外周血單個核細(xì)胞的增殖作用，將重組蛋白分別與細(xì)胞共培養(yǎng)，用CCK-8法檢測增殖效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HC29在三個濃度梯度下與對照組比較具有極顯著的增殖效果(P＜0.01);重組蛋白GAPDH的三個濃度下的增殖結(jié)果較顯著;其余的四種重組蛋白均有一定的增殖效果，但與對照組比較均不顯著(P＞0.05)。
　　4捻轉(zhuǎn)血矛線蟲六種酶蛋白對山羊巨噬細(xì)胞吞噬功能和分泌N