紅桂木凝集素對B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞生長的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　紅桂木(Artocarpus lingnanensis lectin，ALL)是一種從廣西產(chǎn)亞熱帶地區(qū)特有的桂木屬植物紅桂木種子中分離純化得到的性質(zhì)穩(wěn)定、凝集活性高的植物凝集素。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ALL可促進(jìn)人外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖和活化;誘導(dǎo)人外周血和小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞增殖與成熟;誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞和Jurkat T淋巴細(xì)胞的凋亡。為了全面了解ALL對其他免疫細(xì)胞的調(diào)控作用，本研究以小鼠脾臟來源B

2、細(xì)胞、NK92MI細(xì)胞為研究對象，觀察ALL對其生長的影響，并初步探索其機(jī)制，以期對ALL的免疫調(diào)控作用有新的認(rèn)識，為其在臨床疾病防治等方面的開發(fā)應(yīng)用奠定良好的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　一、ALL對B細(xì)胞、NK92MI細(xì)胞增殖的影響
　　1、ALL對B細(xì)胞增殖的影響
　　無菌條件下取小鼠脾臟，采用Easy SepTM Mouse B cell isolation kit分離純化B淋巴細(xì)胞，將不同濃度紅桂木

3、凝集素溶液分別作用B細(xì)胞72 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，CCK-8法檢測B細(xì)胞的增殖抑制率。
　　2、ALL對NK92MI細(xì)胞增殖的影響
　　常規(guī)培養(yǎng)人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞NK92MI細(xì)胞，NK92MI細(xì)胞經(jīng)不同濃度紅桂木凝集素溶液分別作用48 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，CCK-8法檢測NK92MI細(xì)胞的增殖抑制率;FACS檢測細(xì)胞內(nèi)功能蛋白granzymeA、granzyme B、granuly

4、sin、perforin的表達(dá)。
　　二、ALL受體的初步分析
　　FACS分析ALL與NK92MI細(xì)胞的結(jié)合;FACS分析半乳糖抑制ALL與NK92MI細(xì)胞的結(jié)合;FITC-ALL與PE-CD45雙染的FACS分析;ALL受體與CD45的共定位分析;ALL內(nèi)吞的觀察。
　　三、ALL誘導(dǎo)NK92MI細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究
　　常規(guī)培養(yǎng)人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞NK92MI細(xì)胞，NK92MI細(xì)胞經(jīng)不同濃度

5、紅桂木凝集素溶液分別作用24 h，Annexin-Ⅴ/PI雙染檢測NK92MI細(xì)胞凋亡;透射電子顯微鏡觀察凋亡小體;PI染色法分析細(xì)胞亞二倍體。FACS分析半乳糖對ALL誘導(dǎo)凋亡的抑制作用。熒光定量PCR分析凋亡相關(guān)基因的差異表達(dá)。FACS檢測Caspase-3、Cytochrome-c的表達(dá)，Caspase3抑制劑Z-DEVD-FMK對ALL誘導(dǎo)凋亡的抑制作用。
　　結(jié)果:
　　一、ALL對B細(xì)胞、NK92MI細(xì)胞增殖的影

6、響
　　1、ALL抑制B細(xì)胞的增殖
　　不同濃度的紅桂木凝集素作用B細(xì)胞72 h后，對照組細(xì)胞生長密集，狀態(tài)良好，隨著紅桂木凝集素濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量明顯逐漸減少，高倍鏡下可見細(xì)胞透光度降低，細(xì)胞皺縮、邊緣不整齊，CCK-8法檢測結(jié)果表明細(xì)胞的增殖受到顯著抑制，呈濃度依賴性，與空白組相比均差異顯著。
　　2、ALL抑制NK92MI細(xì)胞的增殖
　　不同濃度的紅桂木凝集素作用NK92MI細(xì)胞48 h后，對照組細(xì)胞成團(tuán)

7、生長，狀態(tài)良好，隨著紅桂木凝集素濃度的增加，細(xì)胞團(tuán)逐漸變小，高倍鏡下可見細(xì)胞透光度降低，細(xì)胞皺縮、邊緣不整齊，CCK-8法檢測結(jié)果表明細(xì)胞的增殖受到顯著抑制，呈濃度依賴性，與空白組相比均差異顯著。120μg/ml ALL作用NK92MI細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)GranzymeA、Granzyme B、Granulysin、Perforin的表達(dá)，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組Granzyme A、Granulysin表達(dá)偏高，Perf

8、orin表達(dá)偏低，Granzyme B表達(dá)量相差無異。
　　二、ALL受體的初步分析
　　FACS結(jié)果表明ALL可結(jié)合于NK92MI細(xì)胞表面，Gal可減弱其結(jié)合能力，提示ALL通過細(xì)胞表面的糖基而結(jié)合于NK92MI細(xì)胞，NK92MI細(xì)胞、B細(xì)胞經(jīng)FITC-ALL和PE-CD45雙染后，F(xiàn)ACS分析顯示，雙陽性細(xì)胞比例分別達(dá)99.7％、97.6％。NK92MI細(xì)胞、小鼠脾臟B細(xì)胞、人外周血T細(xì)胞經(jīng)FITC-ALL、PE-CD4

9、5雙染后，激光共聚焦分析顯示ALL受體與CD45分子共定位于細(xì)胞膜，提示CD45分子可能是ALL在免疫細(xì)胞表面的受體之一。FITC-ALL作用于NK92MI細(xì)胞不同時(shí)間后，激光共聚焦分析發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長，ALL內(nèi)吞現(xiàn)象越明顯，提示ALL可能通過與NK92MI細(xì)胞表面CD45分子的糖基結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。
　　三、ALL誘導(dǎo)NK92MI細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究
　　不同濃度紅桂木凝集素0μg/ml、60μg/ml、120μg

10、/ml分別作用于NK92MI細(xì)胞24 h后，流式結(jié)果表明，各作用濃度的細(xì)胞凋亡率與空白對照組相比均有所增加，且隨著濃度的增加，細(xì)胞的凋亡越明顯，細(xì)胞凋亡率變化呈濃度依賴性趨勢。進(jìn)一步用透射電子顯微鏡檢測了120ug/ml ALL作用24h后的NK92MI細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞呈現(xiàn)正常的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)胞核形態(tài)，ALL處理組明顯可見細(xì)胞核碎裂形成的染色質(zhì)塊，可見球形凋亡小體。PI染色法檢測亞二倍體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對照組NK92MI細(xì)胞的S

11、ub-G1峰所占比例為17.41％，ALL處理組Sub-G1峰所占比例為57.74％，表明ALL可顯著誘導(dǎo)NK92MI細(xì)胞的凋亡。FACS分析顯示半乳糖處理組NK92MI細(xì)胞凋亡率明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明半乳糖可競爭性抑制ALL誘導(dǎo)的NK92MI細(xì)胞凋亡。熒光定量PCR結(jié)果顯示，120 ug/mlALL處理組與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因Bcl2、Bclxl、Bax表達(dá)下調(diào)，但下調(diào)抗凋亡基因Bcl2、Bclxl作用更明顯。12

12、0μg/ml ALL作用NK92MI細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)caspase-3、cytochrome c的表達(dá)，結(jié)果顯示caspase-3、cytochrome c的表達(dá)均無顯著差異。Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK組凋亡率為50.6％，Z-FA-FMK對照組凋亡率為47.9％，2組之間凋亡率無顯著性差異，提示Caspase-3抑制劑不能抑制ALL誘導(dǎo)的凋亡作用。
　　結(jié)論:
　　一、ALL能夠抑制B