甘露聚糖結(jié)合凝集素對T淋巴細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)作用的初步研究.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)是由多種識別及效應(yīng)分子組成的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),通過模式識別受體如Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)、肽聚糖識別蛋白、甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)等識別病原相關(guān)分子模式(pathogenassociated molecular patterns,PAMPs),構(gòu)成機(jī)體抗感染的第一道防線；并通過抗原提呈、提供共刺激信號和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌,啟動獲得性免疫應(yīng)答并

2、指導(dǎo)其應(yīng)答的性質(zhì)和強(qiáng)度。天然免疫對獲得性免疫應(yīng)答的指導(dǎo)作用特別是其分子機(jī)制,近年來一直是免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
　　 MBL是由肝細(xì)胞分泌的高度保守的血漿蛋白,為C型凝集素超家族中膠凝素(collectins)家族成員。MBL也是一種急性期反應(yīng)蛋白,在應(yīng)激(如病原體感染、外科手術(shù)等)時,其血漿濃度可升高2～3倍。具有“前抗體”(ante-anlfibody)之稱的MBL通過其糖識別域(carbohydrate recogniti

3、on domain,CRD)廣泛識別分布于多種病原體如細(xì)菌、病毒、寄生蟲、真菌等表面的糖結(jié)構(gòu),包括D-甘露糖、L-鹽藻糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰甘露糖胺等。其膠原樣區(qū)(collagen-likeregion,CLR)結(jié)合甘露聚糖相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MBL-associated serine protease,MASP),激活補(bǔ)體凝集素途徑而發(fā)揮溶破和間接調(diào)理功能；或者與吞噬細(xì)胞膠凝素受體結(jié)合,以不依賴補(bǔ)體的方式啟動調(diào)理吞噬。MBL結(jié)構(gòu)

4、基因的3個點(diǎn)突變(CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA)以及啟動子和5’非翻譯區(qū)突變所致血漿MBL低下而引起的調(diào)理吞噬缺損為迄今所發(fā)現(xiàn)的最常見的遺傳性免疫缺損病。MBL缺損者終生處于高度的感染風(fēng)險之中,隨時可患各種感染甚至威脅生命的感染,亦易患自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、Sj(o)gren's綜合征等；而凝集素途徑活性過強(qiáng)時則可能導(dǎo)致炎癥性損傷。
　　 隨著對MBL研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)其除了可識

5、別并清除病原體,還具備許多內(nèi)源性功能(endogenous functions),如結(jié)合自身免疫球蛋白；識別缺血再灌注損傷中暴露的自身抗原或疾病狀態(tài)下修飾的自身抗原；參與對凋亡細(xì)胞的吞噬；結(jié)合腫瘤細(xì)胞并發(fā)揮MBL依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用；抑制DC特異性結(jié)合細(xì)胞間黏附分子3的非整合素(DC-specific intercellular adhesion molecule3-grabbing nonintegrin,DC-SIGN)介導(dǎo)的

6、人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus,HIV)對T細(xì)胞的感染。因此,MBL作為固有免疫中具有多重功能的模式識別分子,不僅僅參與機(jī)體的天然免疫防御,很可能在天然免疫與獲得性免疫之間的相互作用中亦發(fā)揮作用。研究MBL與獲得性免疫的關(guān)系,具有重要的科學(xué)意義和潛在的醫(yī)學(xué)實(shí)踐意義。然而,目前國際上對MBL與獲得性免疫的關(guān)系尚未涉及,其免疫調(diào)節(jié)作用的研究極少,僅見Fraser等報道,MBL可抑制細(xì)菌脂多糖(lip

7、opolysaccharide,LPS)刺激的Mo分泌IL-1而促進(jìn)其產(chǎn)生IL-10、IL-6；Downing等也發(fā)現(xiàn)MBL可與B淋巴細(xì)胞結(jié)合,認(rèn)為MBL作為急性期反應(yīng)蛋白,在炎癥發(fā)生時,可能在血管外與自身細(xì)胞結(jié)合,參與抗炎反應(yīng)。而有關(guān)MBL與T淋巴細(xì)胞之間的相互作用,目前尚未見報道。
　　 本課題組在MBL免疫調(diào)節(jié)作用的研究中發(fā)現(xiàn),人外周血Mo經(jīng)常規(guī)的GM-CSF+IL-4培養(yǎng),將其誘導(dǎo)為未成熟DC后,施以MBL可刺激DC分化

8、成熟,包括其表面分子CD1a、CD83、CD40、CD80、CD86和MHC-DR表達(dá)上調(diào),吞噬酵母多糖顆?；钚越档?激發(fā)初始T細(xì)胞增殖的能力增強(qiáng),分泌IL-12增多；但存在LPS時,MBL則以劑量依賴方式抑制其誘導(dǎo)的DC分化成熟,包括下調(diào)DC的CD83和CD86表達(dá),增強(qiáng)其攝取酵母多糖顆粒的能力,降低其激發(fā)初始T細(xì)胞增殖的活性,抑制其LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-12 p40+p70分泌,這種作用與MBL阻斷LPS-TLR4結(jié)合而降低

9、NF-κB活性有關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)了MBL與獲得性免疫直接聯(lián)系的初步證據(jù):MBL可與B細(xì)胞系Raji細(xì)胞以鈣離子依賴方式結(jié)合,且高濃度MBL可以抑制Raiji的增殖,提示在應(yīng)急狀態(tài)下,血液及局部組織MBL濃度增加,不僅可以發(fā)揮天然免疫作用,而且可以結(jié)合自身淋巴細(xì)胞,進(jìn)而調(diào)控獲得性免疫應(yīng)答的發(fā)生和發(fā)展。
　　 為進(jìn)一步研究MBL對獲得性免疫的調(diào)節(jié)作用,本課題以T細(xì)胞為切入點(diǎn),初步探索MBL對T細(xì)胞功能活性的影響及其分子機(jī)制。我們首先從

10、新鮮冰凍人血漿中提取高純度的具有生物學(xué)活性的天然MBL,進(jìn)而探討MBL對T細(xì)胞激活劑刀豆蛋白A(ConA)、抗CD3單抗(anti-CD3 mAb)、抗CD3單抗+抗CD28單抗(anti-CD3 mAb+anti-CD28 mAb)活化的人外周血單個核細(xì)胞(peripheralblood mononuclear cell,PBMC)以及純化T細(xì)胞的增殖及分泌細(xì)胞因子的影響,并初步探討了MBL對T細(xì)胞直接和間接免疫調(diào)節(jié)功能的機(jī)制。

11、>　　 第一章 MBL對PBMC增殖及分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用
　　 隨著天然免疫研究的深入,發(fā)現(xiàn)膠凝素家族的一些成員和獲得性免疫之間的聯(lián)系越來越緊密。如表面活性物質(zhì)-A(surfactant protein A,SP-A),表面活性物質(zhì)-D(surfactant protein D,SP-D)不僅可與病原體結(jié)合,參與天然免疫防御功能,亦可與多種免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞結(jié)合,調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答。SP-A和SP-D可

12、直接抑制T細(xì)胞增殖及其功能,避免由于免疫應(yīng)答過強(qiáng)造成的肺部損傷。MBL也已證實(shí)可與多種免疫細(xì)胞結(jié)合,調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌。根據(jù)以上研究結(jié)果,以及MBL與SP-A、SP-D的同源性,尤其是其與SP—A在結(jié)構(gòu)上的高度相似,推測MBL很有可能參與獲得性免疫應(yīng)答。本部分工作是研究MBL對T細(xì)胞激活劑誘導(dǎo)的PBMC增殖及分泌細(xì)胞因子是否有調(diào)節(jié)作用。
　　 首先用傳統(tǒng)方法從人冰凍血漿中提取MBL。在提取過程中會污染脂多糖(lipopolysa

13、ccharide,LPS),為排除LPS對研究MBL調(diào)節(jié)功能的干擾作用,應(yīng)用多粘菌素B凝膠柱去除LPS,經(jīng)配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定,MBL仍保持良好的甘露聚糖(mannan)結(jié)合活性。
　　 取人新鮮外周抗凝血,Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC,用含10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),同時加入T細(xì)胞激活劑ConA、anti-CD3 mAb和不同濃度MBL,于

14、37℃,5％CO2培養(yǎng)。CCK-8法檢測PBMC增殖；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbence assay,ELISA)檢測細(xì)胞因子的分泌。在流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)分析中,預(yù)先將PBMC標(biāo)記熒光染料乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,CFDA-SE,CFSE)(2.5μM)后,加入anti-CD3 m

15、Ab和MBL,培養(yǎng)4d后,收集細(xì)胞,標(biāo)記APC-anti-human CD4和PE-anti-human CD8,分析CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖動力學(xué)模型。CCK-8法結(jié)果表明,MBL可明顯抑制anti-CD3 mAb誘導(dǎo)的PBMC增殖。FCM結(jié)果可見,MBL可抑制anti-CD3mAb誘導(dǎo)的PBMC中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖。ELISA結(jié)果顯示,不同濃度MBL均抑制Con A誘導(dǎo)的PBMC分泌IL-2、IL-10

16、與IFN-γ,但明顯上調(diào)IL-6分泌?？筂BL—MASP mAbs可阻斷MBL對IL-2、IFN-γ分泌的抑制作用。以上結(jié)果提示MBL可抑制T細(xì)胞的增殖與活化,為進(jìn)一步研究MBL對純化T細(xì)胞功能的直接調(diào)節(jié)作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二章 MBL對純化T細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用
　　 由于PBMC細(xì)胞成分的復(fù)雜性,無法根據(jù)上述結(jié)果判斷MBL是直接抑制T細(xì)胞活性,還是通過其它免疫細(xì)胞如抗原提呈細(xì)胞(antigen-pr

17、esenting cell,APC)間接抑制T細(xì)胞功能,或二者兼有。本部分工作即分離純化T細(xì)胞,旨在探討MBL對T細(xì)胞增殖及活化的直接調(diào)節(jié)作用。
　　 無菌分離人外周血PBMC,磁式細(xì)胞分選器(magnetic activated cell sortor,MACS)負(fù)選法純化CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞,培養(yǎng)于Con A+MBL的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)72h,CCK-8法檢測細(xì)胞增殖。在FCM分析中,預(yù)先將T細(xì)胞標(biāo)記CFSE后,加入a

18、nti-CD3 mAb、anti-CD3 mAb+anti—CD28mAb和MBL,培養(yǎng)4d后檢測CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖。ELISA檢測MBL在不同時間、對不同劑量的T細(xì)胞激活劑誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ)、Th2型細(xì)胞因子(IL-6、IL-10),以及IL-17a的影響。CCK-8法結(jié)果表明,MBL可抑制Con A誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖。FCM結(jié)果分析,MBL可抑制anti-CD3 mAb、anti-

19、CD3 mAb+anti—CD28mAb刺激的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖。ELISA結(jié)果顯示,在不同時間,MBL均抑制不同劑量的T細(xì)胞激活劑ConA和anti—CD3mAb+anti—CD28mAb誘導(dǎo)的T細(xì)胞分泌IL-2、IL-10、IFN-γ、IL-17a,對IL-6分泌則呈現(xiàn)為正負(fù)調(diào)節(jié)作用。MBL還可抑制ConA誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ。以上結(jié)果為MBL直接調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能的推斷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。尚需要進(jìn)一步解決的

20、問題是:MBL是否通過直接與T細(xì)胞結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用及其結(jié)合特性的測定；與T細(xì)胞結(jié)合所涉及MBL結(jié)構(gòu)域的初步確定(C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域或膠原樣區(qū))；MBL對T細(xì)胞活化的影響；MBL是否還可通過調(diào)節(jié)APC分泌細(xì)胞因子而間接抑制T細(xì)胞的功能。
　　 第三章 MBL對T細(xì)胞調(diào)節(jié)功能的機(jī)制初探
　　 為初步探討MBL對T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的機(jī)制,首先采用細(xì)胞ELISA(Cell-ELISA)和FCM研究MBL與T細(xì)胞及Jurkat細(xì)

21、胞的結(jié)合,以及anti-CRDmAb、anti-MBL-MASP mAb對MBL與T細(xì)胞結(jié)合的影響。FCM分析MBL對T細(xì)胞活化標(biāo)志CD69和HLA-DR表達(dá)的影響。向含有T細(xì)胞激活劑和MBL的培養(yǎng)基中加入10mM Ca++,ELISA檢測INF-γ、IL-2的分泌,以明確Ca++對MBL功能的影響。在阻斷實(shí)驗(yàn)中,將Con A、MBL與anti-MBL-CRD mAb或甘露聚糖(mannan)共同孵育,ELISA檢測IFN-γ的分泌。為

22、明確MBL對T細(xì)胞的抑制作用是否為IL-2依賴途徑,在培養(yǎng)基中加入重組人IL-2(recombinant humanIL-2,rhIL-2)(100IU/ml),ELISA檢測IFN-γ的分泌。細(xì)胞ELISA和FCM結(jié)果均表明,MBL可直接與T細(xì)胞以不依賴鈣離子的方式結(jié)合,anti-MBL-CRD mAb對二者的結(jié)合沒有影響,而可特異性識別MBL-CLR區(qū)的anti-MBL-MASP mAb可抑制MBL與T細(xì)胞結(jié)合；ELISA結(jié)果顯示,

23、外源性Ca++對MBL抑制IFN-γ、IL-2的分泌沒有影響,anti-MBL-CRD mAb和甘露聚糖均不能阻斷MBL對IFN-γ分泌的抑制作用。以上結(jié)果均提示MBL對T細(xì)胞的直接調(diào)節(jié)作用是通過其CLR區(qū)而非CRD區(qū)。MBL與ConA共同刺激T細(xì)胞,T細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD69表達(dá)下降,晚期活化標(biāo)志HLA-DR表達(dá)沒有明顯改變；外源性IL-2可阻斷MBL的抑制作用,提示MBL通過抑制T細(xì)胞活化而非誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑制作用。
　

24、　 為探討MBL對APC分泌細(xì)胞因子的影響,將LPS與MBL同時加入PBMC,ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6)以及趨化性細(xì)胞因子(MCP-1)的表達(dá)?；蛘咴隗w外誘導(dǎo)DC的過程中加入MBL,ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的分泌。ELISA結(jié)果顯示,MBL可抑制LPS刺激PBMC分泌TNF-α及MCP-1,促進(jìn)IL-6分泌；MBL可抑制LPS或TNF-α誘導(dǎo)的成熟DC分泌IL-6,并抑制不成熟DC分泌

25、IL-6。以上結(jié)果提示MBL可能通過抑制APC分泌炎癥細(xì)胞因子,進(jìn)而抑制T細(xì)胞功能。具體機(jī)制目前正在研究中。
　　 綜上,本課題研究發(fā)現(xiàn),MBL可抑制由T細(xì)胞激活劑誘導(dǎo)的PBMC及T細(xì)胞的增殖及多種細(xì)胞因子的分泌,初步獲得了MBL與T細(xì)胞結(jié)合的直接證據(jù),并提出MBL還可能通過調(diào)節(jié)APC分泌細(xì)胞因子進(jìn)而參與對T細(xì)胞的調(diào)節(jié)。提示MBL在識別外源性抗原或自身凋亡細(xì)胞并清除它們的同時,可能向T細(xì)胞傳遞抑制信號,避免由于過強(qiáng)的獲得性免疫應(yīng)

26、答造成的機(jī)體損傷。但具體分子機(jī)制如MBL對不同活化階段T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用,T細(xì)胞上MBL受體的鑒定,與T細(xì)胞結(jié)合的MBL結(jié)構(gòu)域的確定,MBL對T細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響,以及MBL對不同細(xì)胞亞群分化及活性的調(diào)節(jié),均需更深入系統(tǒng)的研究。下一步工作將進(jìn)一步研究MBL對不同亞群T細(xì)胞如CD4+、CD8+T細(xì)胞的活化、增殖及功能的直接調(diào)節(jié)作用,并繼續(xù)探索MBL對APC分化與功能及其對T細(xì)胞應(yīng)答的間接調(diào)節(jié)作用,揭示天然免疫中重要的模式識別分子MB