重組捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖結(jié)合凝集素免疫山羊真胃細(xì)胞因子表達(dá)定位.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖結(jié)合凝集素(Galectin)和半胱氨酸蛋白酶(CysteineProtease)在宿主與寄生蟲相互作用過程中起到了重要的作用。 基于本實(shí)驗(yàn)室以前的研究,本論文主要進(jìn)行了以下的工作： 1.地高辛標(biāo)記探針的制備 根據(jù)GenBank發(fā)表的山羊IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-1B和TNF-α序列設(shè)計(jì)引物,以本試驗(yàn)室保存的相關(guān)細(xì)胞因子為模板,經(jīng)PCR法合成地高辛標(biāo)記的探針。瓊脂糖凝膠電泳

2、檢測(cè)探針分子量大小與設(shè)計(jì)值相符。紫外分光光度法檢測(cè)上述探針的濃度分別為0.82μg/μL、0.56μg/μL、0.72μg/μL、0.69μg/μL、0.91μg/μL和0.78μg/μL。斑點(diǎn)雜交顯示探針的標(biāo)記效率高達(dá)0.001ng。RT-PCR和山羊外周血淋巴細(xì)胞原位雜交法證明地高辛標(biāo)記的探針具有特異性。 2.重組捻轉(zhuǎn)血矛線蟲galectins免疫山羊真胃細(xì)胞因子表達(dá)定位 用重組雌、雄捻轉(zhuǎn)血矛線蟲galectins(

3、rHco-GAL-m/f)免疫山羊,通過原位雜交法對(duì)陰性對(duì)照組(A)、攻蟲對(duì)照組(B)、免疫攻蟲組(C)和免疫非攻蟲組(D)山羊真胃中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α進(jìn)行了定位,并對(duì)真胃中上述細(xì)胞因子的陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量做了分析。結(jié)果顯示：細(xì)胞因子mRNA僅在真胃的黏膜下層中轉(zhuǎn)錄,表現(xiàn)為有藍(lán)色的反應(yīng)信號(hào)。其中A組山羊真胃組織中無反應(yīng)信號(hào),其他3 組真胃黏膜下層中均有上述細(xì)胞因子mRNAS的藍(lán)色反應(yīng)信號(hào)。IL

4、-4和IL-6陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量在B、C和D組山羊真胃黏膜下層中差異顯著(P<0.05),與B組和D組的陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)相比,C組要明顯高于其它兩組。IL-1B、IL-2和TNF-α陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量在B、C和D組山羊真胃黏膜下層中差異顯著(P<0.05),與B組和C組的陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)相比,D組要明顯高于其它兩組。另外,IFN-γ陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量在B組和C組之間的差異不顯著(P>0.05),D組與B組和C組之間差異顯著(P<0.05),且明顯

5、高于其它兩組.以上結(jié)果說明rHco-GAL-m/f能夠有效誘導(dǎo)山羊真胃局部免疫應(yīng)答。 3.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲galectins階段性表達(dá)的檢測(cè) 提取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第1期幼蟲,第2期幼蟲、第3期幼蟲和雌、雄成蟲的天然蛋白,并用Bradfbrd法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。分別用兔抗重組捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌、雄成蟲galectins血清為一抗,通過Western blot法檢測(cè)galectin在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲上述生活階段的表達(dá)并定量分析。結(jié)果顯示,gal

6、ectin只在雌、雄成蟲階段表達(dá),表現(xiàn)為一條約33kDa的條帶,兩種一抗均能識(shí)別雌、雄成蟲galectins。圖像分析表明,galectin在雌蟲中的雜交條帶灰度是雄蟲的1.4倍。 4.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半胱氨酸蛋白酶(Hc58)階段性表達(dá)的檢測(cè) 應(yīng)用在第三章中制備的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第1期幼蟲、第2期幼蟲、第3期幼蟲和雌、雄成蟲天然蛋白,用山羊抗重組捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc58血清為一抗,通過Western blot檢測(cè)Hc58在捻轉(zhuǎn)血矛