豬腎上腺和肝臟3β-HSD基因表達(dá)的品種和性別差異及其分子機(jī)制.pdf

1、類固醇激素的穩(wěn)態(tài)是維持動(dòng)物機(jī)體正常生命活動(dòng)的保障。腎上腺是類固醇激素的主要合成場(chǎng)所，而肝臟則是主要的代謝部位。3β-羥類固醇脫氫酶/△5-△4-異構(gòu)酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase/△5-△4 isomerase，3β-HSD）在類固醇激素的生物合成和降解中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，3β-HSD功能的喪失將阻斷腎上腺和性腺糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素和性激素的生成，肝臟類固醇激素的代謝也受到抑制。3β-HSD的

2、表達(dá)及活性受多種因素的影響，包括類固醇激素對(duì)其反饋?zhàn)饔眉案鞣N轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，然而這些研究主要集中在人的腎上腺細(xì)胞系，豬3β-HSD表達(dá)調(diào)控的研究還很少。因此，本研究的目的是探索雄性斷奶仔豬和出欄豬腎上腺和肝臟3β-HSD基因表達(dá)的品種和性別差異及其分子調(diào)控機(jī)制。
　　1雄性斷奶仔豬腎上腺3β-HSD基因表達(dá)的品種差異
　　選取25日齡的雄性斷奶大白豬5頭，二花臉豬6頭，屠宰，收集血清，采集腎上腺樣品，比較兩品種豬腎上腺3β-

3、HSD的表達(dá)，探討品種差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示，二花臉豬血清皮質(zhì)醇(P＜0.01)和睪酮(P＜0.01)水平均顯著高于大白豬;二花臉豬腎上腺3β-HSD mRNA(P＜0.01)和蛋白(P＜0.05)表達(dá)水平也顯著高于大白豬;比較兩品種豬3β-HSD基因的5'-側(cè)翼序列，發(fā)現(xiàn)大白豬3β-HSD基因啟動(dòng)子區(qū)含9個(gè)TTAT的短串聯(lián)重復(fù)序列，二花臉豬僅含8個(gè)重復(fù)，另外兩品種豬還存在3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(singlenucleotid

4、e polymorphisms，SNPs)的差異，這種序列的差異導(dǎo)致二花臉豬3β-HSD基因啟動(dòng)子活性強(qiáng)于大白豬（P＜0.05）;檢測(cè)可能調(diào)控3β-HSD表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)二花臉豬腎上腺CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（CCAAT/enhancer binding proteinβ，C/EBPβ）的mRNA（P＜0.05）和蛋白(P＜0.05)水平均顯著高于大白豬，雄激素受體(androgen receptor, AR)的mRNA

5、（P=0.06）表達(dá)水平有升高的趨勢(shì)，蛋白(P＜0.05)表達(dá)顯著高于大白豬，而糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor, GR)的mRNA（P＜0.05）和蛋白(P＜0.05)表達(dá)水平顯著低于大白豬;染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation，ChIP)研究發(fā)現(xiàn)，二花臉豬腎上腺3β-HSD基因啟動(dòng)子區(qū)C/EBPβ的結(jié)合水平（P＜0.05）及組蛋白乙酰化(H3Ac)水平(P＜0.05

6、)均顯著高于大白豬;免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)顯示，兩品種豬腎上腺GR和AR都可與C/EBPβ結(jié)合。以上結(jié)果提示，雄性斷奶仔豬腎上腺3β-HSD基因表達(dá)的品種差異可能是由3β-HSD基因啟動(dòng)子區(qū)C/EBPβ結(jié)合水平的不同引起的，3β-HSD基因啟動(dòng)子區(qū)序列的差異及GR/AR與C/EBPβ間蛋白-蛋白的互作可能也參與其中。
　　2雄性斷奶仔豬肝臟3β-HSD基因表達(dá)的品種差異
　　肝

7、臟3β-HSD在類固醇激素的代謝失活中起重要作用，然而調(diào)控豬肝臟3β-HSD品種差異表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚。在本研究中我們比較了25日齡雄性斷奶大白豬和二花臉豬肝臟3β-HSD的表達(dá)，并探索可能影響品種差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示，二花臉豬肝臟3β-HSD mRNA表達(dá)水平極顯著低于大白豬(P＜0.01)，與血清皮質(zhì)醇和睪酮水平呈負(fù)相關(guān);對(duì)兩品種豬3β-HSD基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行截短，比較不同片段的啟動(dòng)子活性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)3β-HSD基因啟

8、動(dòng)子片段含TTAT重復(fù)序列時(shí)（-588bp～+156bp），二花臉豬3β-HSD啟動(dòng)子活性大于大白豬(P＜0.01)，但當(dāng)截短至僅含一個(gè)SNP時(shí)(-341 bp～+156bp)，二花臉豬3β-HSD啟動(dòng)子活性極顯著低于大白豬(P＜0.01);二花臉豬肝臟AR(P=0.07)和C/EBPβ（P＜0.05）的mRNA表達(dá)水平顯著低于大白豬，而GRmRNA(P＜0.05)表達(dá)水平及AR(P＜0.05)、GR(P＜0.01)和磷酸化的GR(Se

9、r211)(P＜0.01)的蛋白表達(dá)水平均顯著高于大白豬;ChIP研究發(fā)現(xiàn)，二花臉豬肝臟3β-HSD啟動(dòng)子區(qū)GR的結(jié)合水平顯著低于大白豬（P＜0.05），而AR和C/EBPβ在兩品種豬無(wú)差異;Co-IP未發(fā)現(xiàn)GR、AR可以和C/EBPβ結(jié)合。以上結(jié)果提示，雄性斷奶仔豬肝臟3β-HSD基因表達(dá)的品種差異可能是由3β-HSD基因啟動(dòng)子區(qū)GR結(jié)合水平的不同引起的，兩品種豬3β-HSD近端核心啟動(dòng)子部分的SNP可能也是造成品種差異表達(dá)的原因之一

10、。
　　3出欄豬腎上腺3β-HSD基因表達(dá)的性別差異
　　選取28頭杜長(zhǎng)大三元雜交仔豬，分為三組，其中8頭雄性仔豬和10頭雌性仔豬不做任何處理，另10頭雄性仔豬在出生1周時(shí)手術(shù)去勢(shì)，22天斷奶，標(biāo)準(zhǔn)日糧飼喂，直至出欄，屠宰采集樣品。結(jié)果顯示，出欄時(shí)公豬血清睪酮水平極顯著高于去勢(shì)公豬和母豬(P＜0.01)，而母豬雌二醇水平極顯著高于公豬和去勢(shì)公豬（P＜0.01）;公豬和去勢(shì)公豬腎上腺3β-HSD mRNA表達(dá)水平顯著低于母豬(

11、P＜0.05)，但蛋白表達(dá)無(wú)差異;對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究發(fā)現(xiàn)，公豬AR(P＜0.05)和GR(P＜0.05) mRNA表達(dá)水平顯著低于母豬，而蛋白表達(dá)僅C/EBPβ顯著低于母豬(P＜0.05);ChIP結(jié)果顯示，母豬3β-HSD基因啟動(dòng)子區(qū)C/EBPβ的結(jié)合水平均顯著高于公豬和去勢(shì)公豬(P＜0.05);Co-IP未發(fā)現(xiàn)C/EBPβ可以和AR結(jié)合。以上結(jié)果提示，C/EBPβ可能參與調(diào)控了出欄豬腎上腺3β-HSD的性別差異表達(dá)。
　　4

12、出欄豬肝臟3β-HSD基因表達(dá)的性別差異
　　以往研究已表明，豬肝臟3β-HSD的表達(dá)存在性別差異，然而形成這種差異的分子機(jī)制并不清楚。因此我們選用不同性別的出欄豬作為研究對(duì)象，探討豬肝臟3β-HSD表達(dá)性別差異的分子調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示，公豬3β-HSD mRNA(P＜0.05)和蛋白表達(dá)(P＜0.05)水平均顯著低于去勢(shì)公豬和母豬;對(duì)調(diào)控3β-HSD的轉(zhuǎn)錄因子的研究發(fā)現(xiàn)，公豬肝臟AR mRNA表達(dá)水平顯著低于去勢(shì)公豬和母豬（P＜

13、0.05），而C/EBPβ mRNA顯著高于去勢(shì)公豬和母豬（P＜0.05），檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，公豬AR蛋白表達(dá)顯著低于去勢(shì)公豬和母豬(P＜0.05)，公豬C/EBPβ的蛋白表達(dá)水平顯著低于去勢(shì)公豬（P＜0.05），與母豬無(wú)差異;ChIP分析發(fā)現(xiàn)，公豬3β-HSD基因啟動(dòng)子區(qū)GR的結(jié)合水平顯著高于去勢(shì)公豬和母豬（P＜0.05），另外公豬3β-HSD基因啟動(dòng)子區(qū)H3Ac水平顯著低于去勢(shì)公豬和母豬(P＜0.05);Co-IP未檢測(cè)到