柴苓湯對慢性環(huán)孢素A腎病大鼠腎臟細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：探討細(xì)胞增殖在環(huán)孢素A(CsA)慢性腎損傷中的作用及中藥復(fù)方制劑柴苓湯對其的影響，為臨床防治CsA腎毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分：柴苓湯對慢性環(huán)孢素A腎病大鼠腎功能及腎組織病理形態(tài)學(xué)的影響
　　1.動(dòng)物分組、模型復(fù)制及藥物治療
　　40只雌性SD大鼠隨機(jī)分為四組，即對照組(Control)、模型組(CsA)、柴苓湯組(CsAC)及纈沙坦組(CsAV)，每組10只。采用CsA30mg/(kg·

2、d)經(jīng)口灌服28天的方法，建立慢性CsA腎病大鼠模型。對照組每日灌胃給與等容量橄欖油。造模的同時(shí)，兩治療組分別給予柴苓湯3g(kg·d)和纈沙坦10mg/(kg·d)治療，模型組和對照組則每日給予等容量生理鹽水。
　　2.指標(biāo)檢測
　　2.1體重及尿液檢測每周末將所有大鼠移入代謝籠中，分別測量每只大鼠體重、24小時(shí)尿量及尿肌酐。
　　2.2腎臟病理形態(tài)學(xué)檢測切取大鼠左側(cè)腎臟組織，4％多聚甲醛固定，常規(guī)制作石蠟切片后分別

3、行HE、Masson及PAS染色，觀察腎組織病理形態(tài)改變，并參照Katafuchi評分標(biāo)準(zhǔn)從炎性細(xì)胞浸潤、間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮三方面對腎小管間質(zhì)損傷程度進(jìn)行分析。
　　2.3腎功能檢測實(shí)驗(yàn)第29天，所有大鼠被處死，取血以檢測大鼠血尿素氮(BUN)及血清肌酐(SCr)，并計(jì)算出肌酐清除率(CCr)。
　　3.統(tǒng)計(jì)分析
　　數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-χ±s)表示，使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間比較采用單因素方

4、差分析。顯著性差異水平以0.05和0.01為標(biāo)準(zhǔn)。
　　第二部分：柴苓湯對慢性環(huán)孢素A腎病大鼠腎臟增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響
　　1.動(dòng)物分組、模型復(fù)制、藥物治療及統(tǒng)計(jì)分析方法同第一部分。
　　2.指標(biāo)檢測實(shí)驗(yàn)第29天，取大鼠部分腎臟組織，分別采用免疫組化、Western-Blot、RT-PCR及流式細(xì)胞術(shù)四種方法檢測大鼠腎臟PCNA表達(dá)。
　　2.1免疫組化：采用SABC法，以光鏡下腎臟組織出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表

5、達(dá)。
　　2.2 Western Blot：切取100mg-70℃冰箱中保存的腎組織，提取蛋白并定量，依次進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)及顯色。最后用富士LAS-4000LIMINESCENT圖像分析儀拍照。
　　2.3 RT-PCR：根據(jù)Trizol RNA抽提試劑盒要求，切取100mg液氮保存的腎組織，提取腎皮質(zhì)總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。取10μL產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下拍照，應(yīng)用BIO-PRO

6、FIF凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。
　　2.4流式細(xì)胞術(shù)：取70％酒精固定的腎組織，制作腎間質(zhì)、腎小管單細(xì)胞懸液后，離心沉淀2分鐘。取0.1ml單細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL)，加入碘化丙啶，4℃冰箱避光染色30 min，以500目銅網(wǎng)過濾。采用美國Beckton Dickinson.公司FACScan-420型流式細(xì)胞儀檢測PCNA熒光指數(shù)(FI)、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期，并根據(jù)公式(PI)=(S+G2M)/(G0/G1+

7、S+G2M)×100％計(jì)算出增殖指數(shù)(PI)。
　　第三部分：柴苓湯對慢性環(huán)孢素A腎病大鼠腎臟結(jié)締組織生長因子表達(dá)的影響
　　1.動(dòng)物分組、模型復(fù)制、藥物治療及統(tǒng)計(jì)分析方法同第一部分。
　　2.指標(biāo)檢測實(shí)驗(yàn)第29天，取大鼠部分腎臟組織，分別采用免疫組化、Western-Blot、RT-PCR檢測大鼠腎臟CTGF的表達(dá)。操作步驟同第二部分。
　　第四部分：柴苓湯對慢性環(huán)孢素A腎病大鼠腎臟纖維連接蛋白表達(dá)的影響

8、>　　1.動(dòng)物分組、模型復(fù)制、藥物治療及統(tǒng)計(jì)分析方法同第一部分。
　　2.指標(biāo)檢測實(shí)驗(yàn)第29天，取大鼠部分腎臟組織，分別采用免疫組化、Western-Blot、RT-PCR檢測大鼠腎臟FN的表達(dá)。操作步驟同第二部分。
　　結(jié)果：
　　第一部分：柴苓湯對慢性環(huán)孢素A腎病大鼠腎功能及腎組織病理形態(tài)學(xué)的影響
　　1.體重及尿量檢測結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)第一、二周，所有大鼠體重均有所增加，但同時(shí)段各組間比較無明顯差異(P>

9、0.05)。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，模型組大鼠體重增長減緩，至第四周末，模型組體重較前一周反而下降，且與同時(shí)段兩治療組相比有顯著差異(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)的前3周，四組大鼠24小時(shí)尿量比較無明顯差異(P>0.05)。然而至實(shí)驗(yàn)第4周末，模型組尿量較其余三組顯著減少(P<0.05)。
　　2.病理形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果
　　HE染色結(jié)果：對照組未見明顯異常；模型組腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤，同時(shí)可見腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落；柴苓湯組及纈沙坦組

10、腎臟損傷程度明顯輕于模型組。Masson染色結(jié)果：對照組腎間質(zhì)可見少量膠原成分。模型組腎間質(zhì)膠原成分大量沉積，并呈條帶狀分布；柴苓湯及纈沙坦組腎間質(zhì)膠原成分較模型組明顯減少。半定量分析結(jié)果表明，模型組腎小管間質(zhì)損傷各項(xiàng)參數(shù)積分值均明顯高于對照組(P<0.01)。與模型組相比，兩治療組各項(xiàng)參數(shù)積分值則明顯降低(P<0.05，P<0.01)。PAS染色結(jié)果：模型組腎小球基底膜增厚，細(xì)胞基質(zhì)沉積增多，系膜細(xì)胞增生明顯。柴苓湯組及纈沙坦組大鼠腎

11、組織病理損傷較模型組顯著減輕。
　　3.腎功能檢測結(jié)果
　　與對照組比較，模型組血肌酐、尿素氮水平明顯升高(P<0.01)，但同時(shí)該組肌酐清除率顯著降低(P<0.01)。柴苓湯組及纈沙坦組血肌酐、尿素氮水平較模型組明顯降低(P<0.01)，肌酐清除率則均較模型組明顯升高(P<0.05)。兩治療組間比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　第二部分：柴苓湯對慢性環(huán)孢素A腎病大鼠腎臟增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響
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12、.免疫組化結(jié)果
　　對照組僅見少量PCNA陽性細(xì)胞。模型組陽性細(xì)胞較對照組明顯增多(P<0.01)。柴苓湯及纈沙坦組PCNA陽性細(xì)胞較模型組顯著減少(P<0.01)，但兩治療組相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　2. Western-Blot結(jié)果
　　對照組腎組織PCNA蛋白僅少量表達(dá)，與之相比，模型組表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)。經(jīng)柴苓湯及纈沙坦治療，PCNA蛋白表達(dá)被下調(diào)(P<0.05)，兩治療組相比無明顯差異

13、(P>0.05)。
　　3. RT-PCR結(jié)果
　　與對照組相比，模型組PCNAmRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)。柴苓湯及纈沙坦均可下調(diào)PCNAmRNA高表達(dá)(P<0.05)，兩治療組相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果
　　4.1熒光指數(shù)模型組熒光指數(shù)明顯高于對照組(P<0.01)；與模型組比較，柴苓湯組及纈沙坦組熒光指數(shù)顯著降低(P<0.01)。
　　4.2細(xì)胞周期模型組處

14、于S期的細(xì)胞比例較對照組增多(P<0.01)，而處于G0/G1期的細(xì)胞比例較對照組減少(P<0.01)；柴苓湯及纈沙坦組處于S期的細(xì)胞比例較模型組明顯降低(P<0.01)，處于G0/G1期的細(xì)胞比例較模型組增多(P<0.01)。各組G2/M期細(xì)胞比例相對接近，組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　4.3增殖指數(shù)、凋亡率與對照組比較，模型組腎臟細(xì)胞增殖指數(shù)明顯升高(P<0.01)，凋亡率較對照組也有所增加，但兩組凋亡率的差異沒

15、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組凋亡率/增殖指數(shù)的比值顯著低于對照組(P<0.01)；與模型組比較，柴苓湯組及纈沙坦組增殖指數(shù)均明顯降低(P<0.01)，凋亡率則分別升高(P<0.01，P<0.05)，凋亡率/增殖指數(shù)的比值也提高(P<0.01)。
　　第三部分：柴苓湯對慢性環(huán)孢素A腎病大鼠腎臟結(jié)締組織生長因子表達(dá)的影響
　　1.免疫組化結(jié)果
　　對照組大鼠腎臟組織CTGF蛋白表達(dá)為弱陽性。模型組CTGF蛋白表達(dá)明

16、顯增強(qiáng)，主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)柴苓湯及纈沙坦治療后，CTGF蛋白表達(dá)顯著減弱。
　　2. Western-Blot結(jié)果
　　對照組大鼠腎組織CTGF蛋白表達(dá)量很少，與之相比，模型組則顯著增強(qiáng)，柴苓湯組及纈沙坦組CTGF蛋白表達(dá)較模型組明顯減少。
　　3. RT-PCR結(jié)果
　　與對照組相比，模型組CTGFmRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)，柴苓湯組及纈沙坦組CTGFmRNA表達(dá)較模型組明顯降低(

17、P<0.05)。
　　第四部分：柴苓湯對慢性環(huán)孢素A腎病大鼠腎臟纖維連接蛋白表達(dá)的影響
　　1.免疫組化結(jié)果
　　對照組FN蛋白少量表達(dá)，主要見于腎小管上皮細(xì)胞；模型組FN蛋白表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)；經(jīng)柴苓湯及纈沙坦治療后，F(xiàn)N蛋白表達(dá)明顯減少。
　　2. Western-Blot結(jié)果
　　對照組腎組織FN蛋白僅少量表達(dá)，與之相比，模型組表達(dá)增強(qiáng)，柴苓湯及纈沙坦均可顯著下調(diào)FN的高表達(dá)。
　　3. RT

18、-PCR結(jié)果
　　與對照組相比，模型組FNmRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)。柴苓湯組及纈沙坦組FNmRNA表達(dá)均顯著減少(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.柴苓湯可減輕CsA誘導(dǎo)的腎臟病理損害，改善腎功能。
　　2.柴苓湯可通過下調(diào)慢性CsA腎病大鼠腎組織PCNA的高表達(dá)及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖活動(dòng)，延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。
　　3.柴苓湯可抑制慢性CsA腎病大鼠腎組織中CTGF蛋白及基因的表達(dá)