藏茵陳及其復方對MHV-A59病毒性肝炎濕熱證模型的作用及凋亡相關機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 嶺南地區(qū)氣候炎熱、雨水充沛,擁有獨特的“濕熱”環(huán)境。該地常年高溫,雨熱同季釀成嶺南人的陽熱體質,加之久居潮濕之地,嗜好生冷油膩,形成濕熱為標的體質。而正是嶺南地區(qū)這種溫暖潮濕的氣候、人口稠密,交通發(fā)達的環(huán)境,成為了病毒復制及流行的溫床,加之嶺南人濕熱體質,也為病毒性疾病提供了易感條件。因此,嶺南地區(qū)已成為傳染疾病發(fā)生和流行的重要危險地帶,許多傳播病原如流感病毒、冠狀病毒和輪狀病毒等都在這里大量存在或最早發(fā)現(xiàn),如

2、2003年爆發(fā)的 SARS首發(fā)病例就在中國南方。小鼠肝炎病毒屬于冠狀病毒的一種,其主要導致冠狀病毒性肝炎,由于其不易感染人,如今已被用作研究人類冠狀病毒良好的替代品,所以在嶺南地區(qū)研究冠狀病毒引起的濕熱證意義重大。目前在市面上西醫(yī)抗病毒感染的主要有疫苗和抗病毒制劑,但疫苗的制作存在滯后性,面對病毒的變異顯得防不勝防；抗病毒的制劑也只有在早期才能達到預期效果,而中藥在治療此類疾病有獨特優(yōu)勢。藏茵陳是藏藥中最具特色的治療肝膽系統(tǒng)疾病的良藥,

3、具有清熱、解毒、清肝利膽功效,已被用于各種肝臟疾病的治療,逐步受到相關專家和學者的重視。因此,探討藏茵陳抗冠狀病毒引起的濕熱證作用相關機制,具有其獨特意義,為該藥治療此類疾病打下理論基礎。
　　 目的：
　　 建立符合臨床癥狀的冠狀病毒性肝炎濕熱證模型,評價造模因素對模型的作用地位,探討模型的相關致病機制,并給予藏茵陳解毒湯進行治療,觀察藥物對模型的作用,反證上述機理,為冠狀病毒性感染濕熱證提供新的致病機制基礎理論和新的

4、治療藥物參考。
　　 方法：
　　 實驗分為兩個部分。第一部分:MHV-A59病毒性肝炎濕熱證模型的建立。將12只SPF級 BALB/c小鼠隨機分為正常組和模型組,每組6只。由造模之日起,常溫飼養(yǎng)9d,其中對照組用普通飼料喂養(yǎng),模型組用高脂飼料(由80％普通飼料+8％蜂蜜+12％豬油配制,由廣東省醫(yī)學實驗動物中心制備)喂養(yǎng),兩組均給予50g/d,自由飲水。至第10d時模型組用注射器腹腔注射 MHV-A59病毒0.5ml,

5、病毒稀釋液濃度為10-5.5,對照組則腹腔注射等量的生理鹽水,分別于病毒感染后第1d、3d和5d放入氣候模擬艙(溫度32±0.5℃,相對濕度60±5％)暴露3h,其余時間放置常溫環(huán)境和肥甘飼料喂養(yǎng),正常組于常溫和普通飼料飼養(yǎng)。造模全程為15d。自造模1d、9d和14d的9:30AM在自然環(huán)境下(溫度25℃,相對濕度60％)用數(shù)字肛溫計和數(shù)字天平測量兩組小鼠肛溫和體重；于造模后眼球采血并離心得血清,解剖小鼠后將肝臟用4％多聚甲醛液固定。用

6、磷酸甘油氧化法測定兩組小鼠血清血脂四項,用ELISA法測定血清。TNF-α含量,用HE染色法觀察小鼠肝臟病理切片變化,用RT-PCR法檢測小鼠肝臟 MHV-A59病毒,比較兩組小鼠肛溫體重、血脂、TNF-α含量、肝臟病理變化及病毒感染確定。第二部分:藏茵陳及其復方對MHV-A59病毒性肝炎濕熱證的作用及相關機制探討。將64只SPF級 BALB/c小鼠隨機分成正常組、單純濕熱組(簡稱:濕熱組)、單純病毒組(簡稱:病毒組)、模型組、陽性藥物

7、組(簡稱:陽性組)、蒿芩清膽湯組(簡稱:蒿芩組)、藏茵陳解毒湯組(簡稱:藏復組)和藏茵陳組(簡稱:藏單組)8個組,每組8只。造模方法同實驗第一部分,四個藥物組由病毒感染后2h內(nèi)給藥,中藥2次/d,西藥1次/d。造模結束后制備血清和肝勻漿,用賴氏法測定血清ALT、AST含量,用TBA法測定肝勻漿MDA含量和SOD活性,用HE染色法觀察小鼠肝臟病理切片變化,用分光光度法測定肝勻漿 caspase3的活性,用熒光定量PCR法測定肝組織MHV-

8、A59病毒含量、FasmRNA和caspase3mRNA的表達,比較不同造模因素組的肝功兩項變化、脂質過氧化水平變化和 caspase3活性的差異；比較模型組和各藥物組之間肝功、脂質過氧化、病毒含量、病理切片以及FasmRNA和 caspase3mRNA表達的差異。
　　 結果：
　　 第一部分:MHV-A59病毒性肝炎濕熱證模型的建立。
　　 1.模型組小鼠一般狀態(tài)觀察
　　 與正常組小鼠相比,模型組小

9、鼠活動減少,呼吸急促,扎堆蜷縮,四肢癱瘓成壁虎狀,反應遲鈍,精神狀態(tài)差,進食、飲水量明顯減少,體毛脫落蓬松,體重明顯減輕,大便粘滯,量多。肉眼下肝臟體積縮小,表面粗糙,有彌漫性出血點,質地脆,邊緣銳,呈暗紫色。
　　 2.小鼠肛溫、體重變化
　　 (1)造模1d時,兩組小鼠肛溫分別為:(34.37±0.38)℃和(34.63±0.36)℃；9d時分別為(34.35±0.16)℃和(34.87±0.28)℃；14d時(34

10、.30±0.44)℃和(34.30±0.44)℃。兩組小鼠相比,肛溫變化差異有統(tǒng)計學意義(根據(jù)球形檢驗結果 W=0.616,P=0.113,不拒絕球形假設,故 F=70.167,P=0.000)。(2)造模1d時,兩組小鼠體重分別為:(9.17±0.44)g和(9.44±0.39)g；9d時分別為(15.83±0.57)g和(18.05±0.51)g:15d時(18.02±0.19)g和(16.21±0.30)g。模型組小鼠在喂養(yǎng)高脂飼

11、料9d時體重增加顯著,至14d時(病毒+高溫后)模型組小鼠體重有所下降,兩組小鼠相比,體重變化差異有顯著統(tǒng)計學意義(根據(jù)球形檢驗結果 W=0.906,P=0.641,不拒絕球形假設,故 F=5.509,P=0.000)。
　　 3.小鼠血脂變化
　　 正常組與模型組的TG分別為:(1.84±0.56)mmol/l和(4.70±0.95)mmol/l,差異有顯著統(tǒng)計學意義(t=6.436,P=0.000)；兩組的 CHOL

12、分別為:(4.02±0.28)mmol/l和(5.33±1.01)mmol/l,差異有顯著統(tǒng)計學意義(t=3.042,P=0.024)。
　　 4.小鼠肝臟病理切片變化
　　 與正常組相比,模型組小鼠肝病理切片中肝小葉界限不清,塌陷,中央靜脈周圍肝細胞索排列紊亂、腫大,呈氣球樣變,胞質疏松淡染,細胞核大小、形狀不一,胞漿呈嗜酸性,未見纖維間隔形成。
　　 5.小鼠血清 TNF-α變化
　　 正常組與模型組

13、血清的 TNF-α含量為(147.16±4.76)pg/ml和(188.10±10.09)pg/ml,模型組明顯比正常組升高,差異有顯著統(tǒng)計學意義(t=8.987,P=0.000)。
　　 第二部分:藏茵陳及其復方對 MHV-A59病毒性肝炎濕熱證作用及相關機制探討。
　　 1.肝臟MHV-A59病毒含量的變化
　　 各組小鼠肝臟病毒含量的相對拷貝數(shù)分別為:病毒組(22.92±3.55)、模型組(25.43±5.

14、56)、陽性組(21.26±6.21)、蒿芩組(20.75±5.37)、藏復組(18.16±4.96)和藏單組(20.10±5.66)。各種藥物對模型小鼠 MHV-A59病毒含量均有不同程度地降低,其中以藏茵陳解毒湯作用最明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.017)。
　　 2.小鼠肝臟病理切片的變化
　　 不同造模因素對肝組織有不同程度的損害性改變,其中以模型組最嚴重。在各藥物組小鼠肝臟病理切片中,以藏復組、藏單組和陽性組

15、效果為佳,肝細胞仍有腫脹呈氣球樣變,但破壞減少,排列以中央靜脈向索狀回歸,細胞核相對完整,胞漿嗜酸性物質減少,由此可見三組藥物組中以藏復組效果最為明顯。蒿芩組肝臟病理切片改變不明顯。
　　 3.小鼠血清肝功兩項的變化
　　 各造模因素組小鼠血清 ALT、AST分別為:正常組(10.28±2.22)U/L和(29.97±8.49)U/L、濕熱組(13.03±2.51)U/L和(34.80±7.03)U/L、病毒組(194.

16、70±24.49)U/L和(163.16±18.77)U/L、模型組(227.35±10.22)U/L和(180.82±17.34)U/L。病毒組和模型組 ALT、AST與正常組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P=.001,P=0.000；正常組與濕熱組比較無統(tǒng)計學意義(P=0.794,0.607);模型組比病毒組升高明顯,但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.372,0.067)。各藥物組小鼠血清 ALT、AST分別為:陽性組(169.20±20.3

17、0)U/L和(137.931±12.197)U/L、蒿芩組(202.43±9.86)U/L和(175.146±14.781)U/L、藏復組(182.73±18.11)U/L和(145.08±20.423)U/L、藏單組(178.97±16.45)U/L和(139.824±13.153)U/L。與模型組比較,各藥物組在肝功兩項上均有不同程度的降低。藏復組和藏單組均有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.040,0.001,P=0.016,0.000),

18、但兩者比較無統(tǒng)計學意義(P=0.1000,P=0.577)。蒿芩組與藏復組相比,ALT差值無顯著差異(P=0.632),AST差異有顯著性(P=0.003)。
　　 4.小鼠肝組織脂質過氧化的變化
　　 各組小鼠 MDA、SOD分別為:正常組(7.18±1.48)nmol/mg和(129.26±7.21)U/mg、濕熱組(10.48±1.41)nmol/mg和(122.85±7.91)U/mg、病毒組(24.05±4.4

19、8)nmol/mg和(99.22±2.88)U/mg、模型組(39.03±7.76)nmol/mg和(94.82±11.13)U/mg。病毒組和模型組 MDA含量明顯比正常組和濕熱組高,與正常組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.000),濕熱組MDA含量比正常組稍高,差異有顯著性(P=0.011)；病毒組和模型組SOD含量明顯比正常組和濕熱組低,與正常組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.000),濕熱組與正常組比較,SOD差異無統(tǒng)計學意

20、義(P=0.880)。各藥物組小鼠血清 MDA、SOD分別為:陽性組(21.30±3.44)nmol/mg和(120.01±9.02)U/mg、蒿芩組(29.07±3.94)nmol/mg和(106.00±5.12)U/mg、藏復組(23.61±5.56)nmol/mg和(118.11±12.17)U/mg、藏單組(26.14±5.65)nmol/mg和(114.07±8.90)U/mg。在MDA含量上,藏復組和藏單組與模型組比較的差異

21、有統(tǒng)計學意義(P=0.013,0.049),兩組之間比較無統(tǒng)計學意義(P=1.000);在 SOD活性上,藏復組和藏單組與模型組差異比較均有統(tǒng)計學意義(P=0.031,0.045),兩組之間比較無統(tǒng)計學意義(P=1.000)。藏復組與蒿芩組比較MDA、SOD差異均無顯著性(P=0.537,0.377)。
　　 5.小鼠肝組織caspase3活性的變化
　　 各因素組小鼠 caspase3活性相對吸光度分別為:正常組(0.

22、148±0.028)、濕熱組(0.215±0.037)、病毒組(0.293±0.033)和模型組(0.371±0.051)。與正常組相比,濕熱組、病毒組和模型組 caspase3活性相對吸光度值均有不同程度的升高,其中以模型組最高,病毒組次之。三組與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011,0.000,0.000)。各藥物組小鼠 caspase3活性相對吸光度分別為:陽性組(0.261±0.051)、蒿芩組(0.304±0.067)、

23、藏復組(0.239±0.035)、藏單組(0.202±0.029)。與模型組相比,以藏茵陳單藥組降低最多,其次為藏復組,差異均有顯著性(P=0.000)。藏復組與藏單組、蒿芩組相比無顯著差異(P=0.145,0.370)。蒿芩組在三組中藥組中降低最弱,與模型組之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　 6.小鼠肝組織Fas mRNA和 caspase3 mRNA表達的變化
　　 各因素組小鼠肝組織 FasmRNA和

24、caspase3mRNA的相對拷貝數(shù)分別為:正常組(1.105±0.166)和(0.317±0.046)、濕熱組(1.657±0.069)和(0.547±0.043)、病毒組(1.548±0.050)和(0.615±0.027)、模型組(1.930±0.080)和(0.867±0.102)。兩種基因表達在濕熱組、病毒組和模型組均有不同程度的上調,與正常組比較差異有顯著性(P=0.000)。各藥物組小鼠肝組織FasmRNA和 caspas

25、c3mRNA的相對拷貝數(shù)分別為:陽性組(1.620±0.061)和(0.622±0.11)、蒿芩組(1.602±0.044)和(0.583±0.05)、藏復組(1.478±0.05)和(0.435±0.084)、藏單組(1.673±0.047)和(0.518±0.103)。與正常組相比,模型組小鼠肝細胞膜上FasmRNA表達明顯增高,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.000)；各藥物組與模型組相比,對其表達均有不同程度的下調,三者與模型組的

26、差異有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.001,0.000,0.003),其中以藏茵陳解毒湯效果最明顯。模型組小鼠肝細胞內(nèi) caspase3mRNA表達比正常組明顯增高,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.000):各藥物組與模型組相比,對其表達均有不同程度的下調,三者與模型組的差異有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.000),其中以藏茵陳解毒湯效果最顯著。藏復組與蒿芩組相比,兩基因表達差異均有顯著性(P=0.024,0.002);與藏單組相比,Fas表達差異有

27、顯著性(P=0.001)。
　　 結論：
　　 1.以MHV-A59病毒為生物致病因子,結合肥甘飲食及濕熱外環(huán)境的復合因素構建的動物模型,從發(fā)病條件、表現(xiàn)和體征等方面符合濕熱證的癥狀,可作為一種新型的溫病濕熱證動物模型,亦是對病證結合動物模型的一種新的探討。
　　 2.藏茵陳解毒湯能有效降低病毒的含量及增加肝細胞的修復,從而減少肝細胞破壞導致的ALT、AST大量釋放,起到較好的護肝作用。
　　 3.藏茵陳