可轉化人工染色體（TAC）文庫載體DNA制備的研究.pdf

1、大片段基因組文庫是進行基因組研究、基因分離及其快速利用的一項重要的基礎性工作，特別是對于大基因組生物來說更是如此?？赊D化人工染色體(Transformationcompetentartificialchromosome，TAC)載體含P1噬菌體和Ri質粒的復制子，因而能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中以單拷貝形式穿梭復制。一旦篩選到目標陽性克隆，可直接利用農(nóng)桿菌轉化系統(tǒng)將其轉到植物體中進行基因功能互補實驗，省去了亞克隆的步驟。 高質量的載

2、體DNA和高質量的大片段DNA是文庫構建的兩個基本要素，目前，已有文獻多側重于文庫的構建及利用和高質量的大片段DNA的獲得，對文庫載體DNA制備的研究則少見報道。本論文以TAC載體pYLTAC17和pYLTAC747H為材料，針對高質量載體DNA制備過程中的關鍵步驟，如質粒載體的分離和純化及檢測、HindⅢ內切酶最佳完全酶切條件選擇、HK脫磷酶最佳完全脫磷效果的載體自連檢測、載體DNA與lambdaDNA/HindⅢ連接能力的檢測及轉化

3、克隆分析等進行了研究。主要結果如下：用QIAprepSpinMiniprep試劑盒分離純化得到的載體pYLTAC17的濃度是300ng/ul，pYLTAC747H的濃度是400ng/ul；將所提純的兩種載體DNA電轉化到大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞中，復蘇培養(yǎng)液涂于LB+Kan25mg.L-1(+5％蔗糖)平板，計算每ul在含有蔗糖和沒有蔗糖的培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落數(shù)的比例，分別是pYLTAC17為1：28885.7，pYLTAC747H為

4、1：119600，均遠小于1/5000，說明兩種載體DNA中的sacB基因均功能正常，可以繼續(xù)進行TAC文庫構建的后續(xù)步驟；對兩種閉環(huán)載體DNA分別用1U、2U、3U、5U和7U共5種不同梯度的HindⅢ酶切處理，電泳檢測得出最適HindⅢ完全酶切條件是3U/ug閉環(huán)載體DNA，37℃，酶切30min；對最適HindⅢ酶切條件得到的兩種線性載體DNA，分別用0.5MBU和1MBU共2種不同梯度的HK脫磷酶處理，經(jīng)電泳和載體連接產(chǎn)物電轉化

5、大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞兩個方面的檢測得出最佳HK脫磷酶完全脫磷條件是1MBU/ug線性載體DNA，30℃，脫磷1h；不同酶切、脫磷處理下所制備的兩種線性載體DNA與lambdaDNA/HindⅢ的連接產(chǎn)物經(jīng)電轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞后涂布于LB+Kan25mg.L-1+5％蔗糖平板上進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)每ug載體DNA經(jīng)3UHindⅢ完全酶切、1MBUHK完全脫磷后的轉化頻率最高，pYLTAC17為1.93×108，pYLTAC747H為

6、2.86×108；隨機挑取兩種載體的轉化子各5個進行檢測，發(fā)現(xiàn)均有不同大小的插入片段，說明所制備載體的連接能力較好；每ugpYLTAC747H載體DNA經(jīng)3UHindⅢ完全酶切、1MBUHK完全脫磷后，與lambdaDNA/HindⅢ的連接產(chǎn)物電轉化大腸桿菌ElectroTen-Blue感受態(tài)細胞，復蘇培養(yǎng)液涂布于pH7.0的LB+12.5mg.L-1潮霉素+5％蔗糖平板上進行培養(yǎng)，初步看出比電轉化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞的轉化效率