陰道毛滴蟲物理圖譜的初步繪制與其細(xì)菌人工染色體（BAC）文庫構(gòu)建條件的研究.pdf

1、陰道毛滴蟲屬單細(xì)胞寄生性原生動(dòng)物，在分類上屬肉鞭門鞭毛亞門的動(dòng)鞭毛綱，毛滴蟲目，毛滴蟲科，毛滴蟲屬，人是它唯一的寄主。陰道毛滴蟲引發(fā)的滴蟲性陰道炎(trichomoniasis)是世界上最常見的性傳播疾病(STD，sexually transmitted disease)之一。 陰道毛滴蟲的基因組約為160Mb，且至少65﹪為重復(fù)序列，為了完成其全基因組的測(cè)序和組裝，繪制一張高精度的物理圖譜尤為重要。本研究以陰道毛滴蟲的EST數(shù)

2、據(jù)、基因組WGS測(cè)序數(shù)據(jù)和Fosmid文庫為基礎(chǔ)，利用STSpooling的方法初步繪制了陰道毛滴蟲的物理圖譜。通過生物信息學(xué)的詳細(xì)分析，實(shí)驗(yàn)在候選的STSs中共設(shè)計(jì)了1353對(duì)PCR引物，篩選了基因組Fosmid文庫中46個(gè)superpools共17664個(gè)克隆，最后參與物理圖譜拼接的有810個(gè)STSs和12555個(gè)克隆。拼接得到382個(gè)comigs和102個(gè)singlets，總長(zhǎng)度為21.9Mb，基因組覆蓋率約為12.5﹪。最長(zhǎng)的c

3、ongtig是由26個(gè)STSs定位在119個(gè)clones上得到的，長(zhǎng)度約為410.2kb。 由于陰道毛滴蟲的基因組比項(xiàng)目開始時(shí)預(yù)期的20Mb左右要大出近8倍，因此用插入片斷較小、基因組覆蓋度低的Fosmid文庫很難繪制高質(zhì)量的物理圖譜，進(jìn)而我們嘗試構(gòu)建平均插入片段大于100kb的基因組BAC文庫，并利用其構(gòu)建高精度的物理圖譜。通過對(duì)陰道毛滴蟲基因組BAC文庫構(gòu)建試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)：陰道毛滴蟲含有較多內(nèi)源性核酸酶(nuclease)，

4、為了避免其降解DNA，需在制備瓊脂糖包埋塊時(shí)加入濃度為1.5﹪的DEPC，才得較好的抑制核酸酶的活性。通過測(cè)驗(yàn)BamHⅠ，EcoR Ⅰ，Hind Ⅲ和Mbo Ⅰ四種限制性內(nèi)切酶對(duì)陰道毛滴蟲基因組的酶切情況，發(fā)現(xiàn)Mbo Ⅰ的酶切位點(diǎn)較多，隨機(jī)性比較好，適宜作為Mbo Ⅰ作為部分酶切的限制性內(nèi)切酶。同時(shí)還對(duì)部分酶切的條件進(jìn)行了研究，確定0.08U/plug Mbo Ⅰ，37℃，60min為最佳部分酶切條件。此外還研究了1.8Kv和2.1Kv