超聲聯(lián)合載SDF-1微泡促M(fèi)SC腎向歸巢修復(fù)糖尿病腎病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　1.探討微泡攜載趨化因子SDF-1的可行性，評(píng)價(jià)載SDF-1微泡的理化性質(zhì)、體內(nèi)外生物學(xué)活性及超聲顯影能力。
　　2.探討診斷超聲聯(lián)合微泡對(duì)大鼠腎臟血管通透性的影響及安全性，觀察超聲聯(lián)合載SDF-1微泡在腎臟靶向釋放SDF-1，提高腎臟SDF-1濃度的可行性及有效性。
　　3.對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)并標(biāo)記，用于體內(nèi)移植示蹤;建立大鼠早期1型糖尿病腎病模型，用于模仿人類疾病的發(fā)展及治療。
　

2、　方法:
　　1.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取、培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。并通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期，透射電子顯微鏡、光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，綜合判斷其生物學(xué)特性。用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的表面標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞成脂及成骨分化判斷其多向分化潛能。分別用綠色熒光蛋白慢病毒轉(zhuǎn)染、CM-DiI染色、DAPI染色的方法對(duì)干細(xì)胞胞漿、胞膜及胞核進(jìn)行標(biāo)記，比較三種標(biāo)記效果后選定合適的方法用于體內(nèi)

3、示蹤。
　　2.用碳二亞胺激活羧基的方法，將SDF-1與含有雙端羧基官能團(tuán)的聚乙二醇(COOH-PEG4000-COOH)共價(jià)連接，制備載SDF-1脂質(zhì)微泡。通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察微泡的形態(tài)、分布，顆粒計(jì)數(shù)器檢測(cè)微泡的粒徑及濃度。用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記SDF-1，制備載FITC標(biāo)記SDF-1微泡。激光共聚焦顯微鏡下觀察FITC標(biāo)記的SDF-1與微泡的結(jié)合情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SDF-1的攜帶率。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢

4、測(cè)載SDF-1微泡中SDF-1的攜載量及包封率，免疫蛋白印跡法(Westernblot)檢測(cè)SDF-1與PEG結(jié)合后的分子量變化。超聲觀察微泡在體外以及在腎臟的增強(qiáng)顯影能力。將載SDF-1微泡溶解后，用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖能力的影響，用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其趨化干細(xì)胞的生物學(xué)活性。
　　3.診斷超聲聯(lián)合微泡作用于大鼠左側(cè)腎臟，以右側(cè)未輻照腎臟作為對(duì)照，用透射電子顯微鏡觀察大鼠腎臟血管超微結(jié)構(gòu)改變，結(jié)合硝酸鑭灌注法觀察

5、腎臟通透性的改變及其恢復(fù)情況。激光共聚焦顯微鏡觀察超聲靶向擊破微泡技術(shù)在左側(cè)腎臟靶向釋放FITC標(biāo)記SDF-1的效果。
　　結(jié)果：
　　1.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法成功提取大鼠骨髓源性MSC，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD29和CD90陽(yáng)性，CD34、CD45和CD11b陰性。細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)培養(yǎng)的MSC具有成脂、成骨分化潛能。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示其具有旺盛的增殖能力，細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示大部分細(xì)胞處于G0+

6、G1期，比例約83.00％。形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞具有未分化細(xì)胞的特征。細(xì)胞可被GFP慢病毒轉(zhuǎn)染，在胞漿及胞核表達(dá)強(qiáng)烈的綠色熒光，并可傳代表達(dá);可被CM-DiI標(biāo)記，在細(xì)胞膜發(fā)出紅色熒光;可被DAPI標(biāo)記，在細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光。
　　2.采用共價(jià)連接的方法成功制備得到載SDF-1脂質(zhì)微泡。光學(xué)顯微鏡下載SDF-1微泡與普通微泡形態(tài)相似，為表面光滑規(guī)整的圓球形，經(jīng)PBS稀釋后分散良好，分布均勻。粒徑檢測(cè)結(jié)果顯示，普通微泡粒徑范圍1.5～5μ

7、m，平均粒徑約1.78μm，微泡濃度約5～9×109/mL;載SDF-1微泡粒徑范圍1.5～5μm，平均粒徑1.92μm，微泡濃度約2～6×109/mL。SDF-1的包封率為79％，攜載量為15.8μg/mL，攜帶率84.4％。激光共聚焦顯微鏡下可見FITC標(biāo)記的SDF-1微泡表面呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示SDF-1（分子量約8kD）與雙端羧基PEG（分子量4kD）結(jié)合后分子量發(fā)生變化，出現(xiàn)三個(gè)不同分子量

8、的條帶，分子量分別為8kD、12kD及20 kD。低機(jī)械指數(shù)超聲造影模式下，普通微泡與載SDF-1微泡均能產(chǎn)生強(qiáng)烈的聲學(xué)信號(hào)，成像能力出色，微泡在大鼠腎臟微血管充盈良好，有良好的增強(qiáng)顯影能力。CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)超聲溶解后的微泡溶液對(duì)體外培養(yǎng)的干細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)載SDF-1微泡溶液具有與SDF-1相似的趨化MSC遷移的能力，AMD3100能抑制該趨化作用，證實(shí)其保留有趨化干細(xì)胞的生物學(xué)活性。
　　3.診斷超聲聯(lián)合

9、微泡作用于大鼠左側(cè)腎臟，超微結(jié)構(gòu)顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性中斷，細(xì)胞間緊密連接開放，血管通透性增加，硝酸鑭示蹤劑漏出至血管外的間質(zhì)中，24h后通透性可恢復(fù)正常。激光共聚焦顯微鏡下可見FITC標(biāo)記SDF-1被成功地靶向釋放至左側(cè)腎臟。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)全骨髓貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法成功提取、培養(yǎng)大鼠骨髓源性MSC，獲得的細(xì)胞具有低分化、高自我更新能力、多向分化潛能的特點(diǎn)，可分別用GFP慢病毒轉(zhuǎn)染、CM-DiI標(biāo)記及DAPI標(biāo)記在細(xì)胞