微泡聯(lián)合超聲上調(diào)SDF-1-CXCR4促M(fèi)SCs歸巢修復(fù)缺血心肌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的:
　　1.探討UTMD調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4軸促靜脈移植MSCs遷移歸巢的作用及可能分子機(jī)制，為超聲聯(lián)合微泡作用下移植MSCs有效歸巢缺血心肌提供理論依據(jù);
　　2.探討診斷超聲聯(lián)合攜SDF-1微泡促靜脈移植的MSCs歸巢缺血心肌，改善大鼠心肌梗死后心功能的可行性和有效性，并初步探討其機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.人骨髓源性與大鼠骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記
　　分別通過(guò)密度

2、梯度離心法和全骨髓貼壁培養(yǎng)法對(duì)成人骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)和大鼠BMSCs進(jìn)行分離、純化及培養(yǎng)，前者用于體外機(jī)制研究，后者用于動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞移植。檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、超微結(jié)構(gòu)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記分子，成脂及成骨誘導(dǎo)分化對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。為在動(dòng)物體內(nèi)示蹤外源性MSCs，用攜帶增強(qiáng)型GFP的慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠MSCs，轉(zhuǎn)染48h后觀察M

3、SCs的綠色熒光表達(dá)及細(xì)胞毒性反應(yīng)。
　　2.大鼠急性心肌梗死模型的建立與評(píng)價(jià)
　　采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型。模型評(píng)價(jià)方法:HE染色、Masson染色以及超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左室收縮功能。
　　3.UTMD上調(diào)SDF-1/CXCR4表達(dá)促心肌梗死后MSCs遷移歸巢的機(jī)制研究
　　(1)體外輻照參數(shù)篩選:按照均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)，考察影響超聲輻照效果的三個(gè)主要參數(shù):超聲輻照時(shí)間、輻照強(qiáng)度和微泡濃度。通過(guò)

4、對(duì)SDF-1分泌量和人MSCs細(xì)胞存活率的檢測(cè)，優(yōu)選最佳的體外輻照參數(shù)配比。
　　(2)體外部分機(jī)制研究:本部分實(shí)驗(yàn)全部使用成人MSCs。為充分驗(yàn)證研究假設(shè)，制備兩種條件培養(yǎng)液用于體外模擬正?；蛉毖醯男募…h(huán)境:①正常氧含量或低氧含量環(huán)境下人心肌細(xì)胞和人心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液;②正?；騇I大鼠心肌組織提取液(myocardial tissue extracts，MTE)。據(jù)此把體外機(jī)制實(shí)驗(yàn)分為“上清液部分”和“MTE部分”

5、。運(yùn)用優(yōu)化的超聲輻照參數(shù)，考察UTMD對(duì)不同條件培養(yǎng)液中MSCs的影響。考察指標(biāo)包括:CCK-8法檢測(cè)MSCs的存活率，ELISA法檢測(cè)SDF-1、黏附分子VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)量，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs膜CXCR4表達(dá)，Western blot法檢測(cè)MSCs胞內(nèi)CXCR4蛋白表達(dá)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)MSCs的CXCR4基因表達(dá)水平，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)評(píng)估MSCs的體外遷移能力。
　　(3)體內(nèi)部分機(jī)制研究

6、:本部分實(shí)驗(yàn)使用大鼠MSCs。GFP標(biāo)記的MSCs移植MI大鼠48h后，觀察外源性MSCs在靜脈移植MSCs組和超聲聯(lián)合微泡+MSCs組缺血心肌區(qū)的熒光分布，并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞用于統(tǒng)計(jì)學(xué)比較;未進(jìn)行GFP標(biāo)記的MSCs移植MI大鼠7d后，免疫組化法和Western blot法檢測(cè)各組（對(duì)照組、靜脈移植MSCs組、超聲+微泡組以及超聲+微泡+MSCs組）心肌缺血區(qū)SDF-1和CXCR4的表達(dá)。
　　4.超聲聯(lián)合攜SDF-1微泡促M(fèi)SCs

7、靶向歸巢并改善大鼠心肌梗死后心功能的研究
　　(1)攜SDF-1微泡的制備及檢測(cè):在本科室普通脂質(zhì)微泡制備方法的基礎(chǔ)上，用共價(jià)結(jié)合法制備攜SDF-1的微泡，光鏡觀察其形態(tài)、分布，顆粒計(jì)數(shù)儀檢測(cè)其粒徑、濃度，流式細(xì)胞儀檢測(cè)SDF-1攜帶率、ELISA法檢測(cè)SDF-1攜載量和包封率。
　　(2) UTMD對(duì)缺氧預(yù)處理MSCs的影響:本部分實(shí)驗(yàn)使用成人MSCs，考察微泡聯(lián)合超聲對(duì)缺氧預(yù)處理MSCs的影響。將MSCs置于低氧環(huán)境(1

8、％O2，94％ N2，5％ CO2)中暴露24h進(jìn)行缺氧預(yù)處理。超聲輻照后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率、流式細(xì)胞儀檢測(cè)膜CXCR4表達(dá)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)評(píng)估其體外遷移能力。
　　(3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):本部分實(shí)驗(yàn)全部使用缺氧預(yù)處理的大鼠MSCs用于移植治療。GFP標(biāo)記的MSCs移植48h后，觀察外源性MSCs在靜脈移植MSCs組、MSCs+UM組（普通微泡）以及MSC+UMSDF-1組（攜SDF-1微泡）缺血心肌區(qū)的熒光分布;未

9、進(jìn)行GFP標(biāo)記的MSCs移植28d后，免疫組化法檢測(cè)各組（對(duì)照組、靜脈移植MSCs組、MSC+UM組以及MSC+UMSDF-1組）心肌缺血區(qū)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)SDF-1和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)水平，HE染色法檢測(cè)心肌缺血區(qū)血管密度(capillary density，CD)，M型超聲評(píng)價(jià)左室收縮功能。
　　研究結(jié)論:
　　1.成功實(shí)現(xiàn)成人MSCs和大鼠MSCs的分離

10、、純化、培養(yǎng)及鑒定。按照MOI=10可成功轉(zhuǎn)染攜帶增強(qiáng)型GFP的慢病毒到大鼠MSCs，轉(zhuǎn)染效率高且傳代后熒光表達(dá)穩(wěn)定，可標(biāo)記MSCs用于體內(nèi)示蹤。
　　2.使用優(yōu)選出的體外超聲輻照參數(shù)(頻率=1MHz，T=30s，Q=0.6W/cm2，MB=106/mL)，微泡聯(lián)合超聲作用于人MSCs，可在較高細(xì)胞存活率的前提下，促進(jìn)SDF-1及黏附分子VCAM-1和ICAM-1的分泌。還可上調(diào)MSCs膜CXCR4的表達(dá)，這可能得益于超聲“聲孔效

11、應(yīng)”和超聲輻照后MSCs胞內(nèi)CXCR4儲(chǔ)備的增加。
　　3.采用缺氧條件下心肌細(xì)胞和心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液與心肌梗死組織提取液兩種條件培養(yǎng)液與MSCs進(jìn)行共培養(yǎng)，均證實(shí)UTMD是通過(guò)上調(diào)SDF-1/CXCR4表達(dá)促M(fèi)SCs歸巢遷移這一分子機(jī)制。
　　4.診斷超聲聯(lián)合微泡作用于MI模型大鼠，可促進(jìn)經(jīng)靜脈移植的MSCs向缺血心肌歸巢，并提高缺血心肌區(qū)SDF-1、CXCR4的表達(dá)。其中，SDF-1的高表達(dá)可能是微泡介導(dǎo)的超聲生物學(xué)

12、效應(yīng)作用于靶區(qū)和UTMD上調(diào)MSCs旁分泌共同作用的結(jié)果。
　　5.靶區(qū)SDF-1表達(dá)量的增加，與外源性MSCs在超聲作用下膜CXCR4的表達(dá)上調(diào)，可能是UTMD上調(diào)SDF-1/CXCR4表達(dá)從而促進(jìn)MSCs遷移歸巢的兩個(gè)相互作用的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。
　　6.采用共價(jià)連接法可成功制備粒徑小，濃度高，分布均勻，連接穩(wěn)定，有較高攜載量和包封率的攜SDF-1微泡。
　　7.缺氧預(yù)處理可使MSCs膜CXCR4表達(dá)上調(diào)，微泡聯(lián)合超聲

13、作用可進(jìn)一步促進(jìn)其功能性表達(dá)，均有利于MSCs的遷移、歸巢。
　　8.攜SDF-1微泡在超聲作用下靶向釋放形成的SDF-1局部高濃度，和缺氧預(yù)處理及超聲輻照引起的MSCs膜CXCR4表達(dá)上調(diào)，二者相互作用，共同促進(jìn)外源性MSCs遷移歸巢到缺血心肌。
　　9.經(jīng)靜脈移植MSCs在攜SDF-1微泡聯(lián)合超聲作用下，歸巢的MSCs數(shù)量進(jìn)一步增加，并通過(guò)超聲空化效應(yīng)和歸巢MSCs的旁分泌效應(yīng)提高心肌缺血區(qū)VEGF和HGF的表達(dá)，促進(jìn)血