超聲輻照微泡介導(dǎo)EPC歸巢至大鼠移植腹主動脈的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　探討采用超聲輻照微泡介導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial progenitor cell，EPC）移植歸巢至大鼠移植腹主動脈的可行性及有效性，為研究干細(xì)胞治療慢性移植物血管病奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　選取10只重量在250-300 g之間的Lewis大鼠用于EPC的提取。無菌操作下提取大鼠的股骨與脛骨、采用 M199培養(yǎng)基將股骨與脛骨內(nèi)的骨髓液沖出、密度梯度離心法分離得到大鼠骨髓單個核細(xì)胞（mo

2、nonuclear cells，MNC）。將MNC種植于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入大鼠血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（Human basic fibroblast growth factor，bFGF）誘導(dǎo)其分化成EPC。采用形態(tài)觀察法、免疫熒光法及攝取 Dil標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白（Acetyl low density lipopro

3、tein，acLDL）與結(jié)合FITC標(biāo)記的荊豆凝集素1（Ulex europaeus agglutinin，UEA-1）法確定EPC。將含有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的慢病毒在293T細(xì)胞中進(jìn)行大量擴(kuò)增，構(gòu)建獲得由慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)入 GFP基因的EPC細(xì)胞株，將轉(zhuǎn)入報告基因的EPC培養(yǎng)24、48和72 h之后，分別置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)情況。建立大鼠腹主動脈移植模型并

4、對其進(jìn)行評價，將30只異系大鼠腹主動脈移植模型隨機(jī)分成5組（Ⅰ：對照組；Ⅱ：超聲+微泡組；Ⅲ：單純 EPC組；Ⅳ：超聲+EPC組；Ⅴ：超聲+微泡+EPC組）。Ⅰ組輸入生理鹽水作為對照；Ⅱ組輸入微泡溶液并采用超聲輻照；Ⅲ組輸入生理鹽水；Ⅳ組輸入生理鹽水并采用超聲輻照；Ⅴ組輸入微泡溶液并采用超聲輻照。上述方法處理結(jié)束后，Ⅰ組和Ⅱ組輸入生理鹽水，Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組注射輸入GFP標(biāo)記的EPC。處理72 h后處死所有的大鼠，置于熒光顯微鏡下觀察血管

5、內(nèi)GFP的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　?、俟鈱W(xué)顯微鏡下觀察：培養(yǎng)過程中的細(xì)胞可呈短梭形、圓形和紡錘形等形態(tài)；熒光顯微鏡下觀察：細(xì)胞 CD133和VEGFR2表面抗原的表達(dá)均為陽性；激光共聚焦顯微鏡下觀察：MNC在培養(yǎng)8 d時可以同時攝取 Dil-AC-LDL與 FITC-UEA-1。以上鑒定結(jié)果表明MNC已分化成EPC。②慢病毒感染內(nèi)皮祖細(xì)胞24 h后，即可看到細(xì)胞內(nèi)有少量的GFP；48 h后，GFP逐漸增多；72 h后，可見

6、所有的細(xì)胞內(nèi)均呈現(xiàn)綠色熒光。③倒置熒光顯微鏡下觀察到上述處理的Ⅰ組和Ⅱ組大鼠移植腹主動脈內(nèi)未發(fā)現(xiàn)綠色熒光，Ⅲ組、Ⅳ組、和Ⅴ組大鼠移植腹主動脈內(nèi)可見綠色熒光，而其中Ⅴ組中綠色熒光的強(qiáng)度顯著高于另外兩組。
　　結(jié)論:
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大鼠MNC在VEGF和bFGF的誘導(dǎo)下可分化成EPC；帶有GFP基因的慢病毒可以有效地感染EPC，使其成功地表達(dá)GFP，且未對細(xì)胞活性造成明顯影響；我們建立的經(jīng)超聲輻照微泡介導(dǎo)EPC移植歸巢至