多種組織細(xì)胞端粒DNA長(zhǎng)度與年齡相關(guān)性的研究.pdf

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文多種組織細(xì)胞端粒DNA長(zhǎng)度與年齡相關(guān)性的研究姓名：李振營(yíng)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：法醫(yī)病理學(xué)指導(dǎo)教師：胡丙杰20040520中山大學(xué)碩士學(xué)位論文材料和方法收集O ～7 2 歲之間共1 0 0 例不同健康個(gè)體的靜脈血和新生兒的臍血、1 0 0例非疾病死亡個(gè)體的腹部皮膚、心肌細(xì)胞，- - 7 0 。C 冰凍保存，常規(guī)酚一氯仿抽提基因組D N A ，紫外分光光度計(jì)測(cè)定D N A 樣品的純度和濃度。含E B 的O ．8 ％瓊脂

2、精微型膠判斷所抽提基因組D N A 的長(zhǎng)度，I ．5 9 9 基岡組D N A 用限制性核酸內(nèi)切酶H i n fI 和R s aI 消化過(guò)夜，0 ．8 ％瓊脂糖凝膠8 0 V 電泳5 ～6 h ，冷卻電泳體系并不停交換正負(fù)極緩沖液，上樣時(shí)包含兩種高分子量D N A 對(duì)照M a r k e r ，真空轉(zhuǎn)膜，陽(yáng)離子尼龍膜紫外交聯(lián)3 m i n ，4 2 。C 水浴預(yù)雜交、雜交，2 ×S S C 、0 ．I ％S D S 洗膜5 m

3、 i n ×2 ，0 ．2 ×S S C 、0 ．I ％S D S5 0 。C 洗膜l h ×2 ，阻滯3 0 ～6 0 m i n ，地高辛抗體孵育3 0 m i n ，x 一線片曝光5 ～2 0 m i n ，積分光密度掃描后用端粒D N A 長(zhǎng)度分析軟件計(jì)算端粒D N A 平均長(zhǎng)度( T R F 值) ，將圖像分析所得的數(shù)據(jù)輸入M i c r o s o f tE x c e l 數(shù)據(jù)庫(kù)。P C R

4、擴(kuò)增結(jié)合毛細(xì)管電泳法：采用G e n eA m pP C RS y s t e m9 7 0 0 擴(kuò)增儀擴(kuò)增。調(diào)整D N A 濃度為1 ．7 5 9 9 ／g l 。P C R反應(yīng)中各成分的最終濃度如下：1 5m M T r i S —H C I P H 8 ．0 ，5 0 m M K C I ，2 m M M g C l 2 ，0 ．2 n b ld N T P ，5 m MD T T ，1 ％D M S O ，1 ．2 5 U 的／

5、U n p l i T a q G o l dD N A聚合酶，T e l l 2 7 0 r i M ：T e l 2 9 0 0 n M 。循環(huán)條件：9 5 o c 1 5 s ，5 4 。C 2 m i n ，分別設(shè)定四種循環(huán)條件：1 8 個(gè)循環(huán)、2 0 個(gè)循環(huán)、2 2 個(gè)循環(huán)、2 4 個(gè)循環(huán)。停止保存于4 。C 。然后再應(yīng)用A B IP R I S M 3 1 0 0G e n e t i CA n a l y z e r 中G

6、 e n e t i cS c a n軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物。3 ，應(yīng)用美國(guó)社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包( s t a t i s t i c sp a c k a g eo fs o c i a l s c i e n c e ，S P S S ) 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果1 ． S o u t h e r n 印跡雜交結(jié)果：x 線片曝光后見(jiàn)雜交譜帶清楚，背景低，不同年齡組間有所差別。經(jīng)積分光密度掃描后，用端粒長(zhǎng)度分析軟件計(jì)算不同個(gè)體的端粒D N