端粒異常與再生障礙性貧血相關(guān)性研究.pdf

1、目的：了解端粒長度在獲得性再生障礙性貧血（acquired aplastic anemia，簡稱“再障”，AA）患者中的變化及shelterin復(fù)合體(TRF1，TRF2，POT1，TIN2，TPP1和RAP1)mRNA表達(dá)情況，尋找AA端?？s短的原因，探討端粒異常誘導(dǎo)AA發(fā)病的途徑。
　　 方法：研究對(duì)象為天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院自2011年5月至2012年5月，明確診斷的SAA患者27例，其中初治者9例，ATG治療后恢復(fù)者18例，

2、正常對(duì)照15名。采用免疫磁珠法分離CD3+T細(xì)胞，Southern雜交法檢測端粒長度，并與臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析;熒光定量PCR法檢測Shelterin復(fù)合體各基因表達(dá)情況;體外實(shí)驗(yàn)部分以初治SAA患者血清，TNF-α和IFN-γ分別干預(yù)培養(yǎng)正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平，熒光定量PCR法檢測POT1基因表達(dá)情況，western雜交法檢測ATR、磷酸化ATR及磷酸化的ATM/ATR底物蛋白表達(dá)水平。<

3、br>　　 結(jié)果：⑴CD3+T細(xì)胞端粒長度在SAA初治組為（4.42±1.13）kb，ATG治療后恢復(fù)組為（5.82±0.97）kb，對(duì)照組為（9.18±3.31）kb。初治組與恢復(fù)組CD3+T細(xì)胞端粒長度無顯著性差異，均較正常對(duì)照組縮短（P均＜0.05）。其中端粒長度短于5kb者，在初治組為77.8％，恢復(fù)組為12.5％。SAA患者CD3+T細(xì)胞端粒長度與TH/S（T輔助/T抑制）呈顯著正相關(guān)，與獲取實(shí)驗(yàn)標(biāo)本時(shí)，不輸血狀態(tài)下患者血紅

4、蛋白水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞比例，白細(xì)胞恢復(fù)時(shí)間，ATG治療后至少一系骨髓細(xì)胞開始恢復(fù)時(shí)間進(jìn)行相關(guān)性分析，均無顯著相關(guān)性(P＞0.05)。外周血白細(xì)胞(PWBC)端粒長度在SAA初治組為（4.89±1.66）kb，ATG治療后恢復(fù)組為（7.04±1.47）kb，對(duì)照組為(11.65±5.55) kb。初治組與恢復(fù)組PWBC細(xì)胞端粒長度無顯著性差異，但均較正常對(duì)照組縮短（p均＜0.05）。SAA患者PWBC端粒長度與T細(xì)胞

5、亞群呈顯著正相關(guān)，與獲取實(shí)驗(yàn)標(biāo)本時(shí)，不輸血狀態(tài)下患者血紅蛋白、血小板數(shù)值及網(wǎng)織紅細(xì)胞比例，呈顯著正相關(guān)(P均＜0.05);與當(dāng)時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，及白細(xì)胞恢復(fù)時(shí)間，ATG治療后至少一系骨髓細(xì)胞開始恢復(fù)時(shí)間，三系骨髓細(xì)胞恢復(fù)時(shí)間，無顯著相關(guān)性（P均＞0.05）。⑵Shelterin復(fù)合體核心蛋白（TRF1、TRF2、TIN2、POT1、TPP1和RAP1）mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測顯示:SAA患者CD3+T細(xì)胞中TRF1、TRF2、T

6、IN2、TPP1在初治組、恢復(fù)組、及對(duì)照組mRNA表達(dá)均無顯著性差異。POT1在初治組相對(duì)表達(dá)量(0.16(0.02-0.29))顯著低于恢復(fù)組(1.17(0.82-1.86))(P＜0.05)，上述兩組與對(duì)照組相比差異無顯著性。RAP1在初治組相對(duì)表達(dá)量(4.14(1.93-6.92))顯著高于恢復(fù)組(0.87(0.30-1.73))和對(duì)照組(0.62(0.45-4.07))，恢復(fù)組與對(duì)照組間差異無顯著性。PWBC細(xì)胞中，POT1基因

7、mRNA相對(duì)表達(dá)量初治組(0.29(0.09-0.58))顯著低于恢復(fù)組(0.78(0.22-2.69))和對(duì)照組(1.88(0.93-3.81))，而TRF1、TRF2、TIN2、TPP1、RAP1在各組間比較mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著性差異。⑶體外分別以SAA患者血清、TNF-α和IFN-γ干預(yù)培養(yǎng)正常人BMMNC，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示:胎牛血清培養(yǎng)組BMMNC總凋亡率為，(9.85±2.67)，SAA血清培養(yǎng)組BMMN

8、C總凋亡率為（13.88±4.55），配對(duì)t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常BMMNC在SAA血清中培養(yǎng)凋亡率明顯增高。ATR系列蛋白檢測中發(fā)現(xiàn):胎牛血清培養(yǎng)組，BMMNC總ATR、磷酸化ATR及磷酸化的ATM/ATR底物蛋白低表達(dá)或不表達(dá);但AA血清培養(yǎng)組、TNF-α和IFN-γ培養(yǎng)組中BMMNC總ATR、磷酸化ATR、及磷酸化的ATM/ATR底物蛋白表達(dá)量明顯增加。且上述蛋白表達(dá)量隨TNF-α濃度增高，呈上升趨勢。
　　 結(jié)論：①SAA患者發(fā)病

9、時(shí)存在CD3+T細(xì)胞和PWBC的端?？s短，且與TH/S呈顯著正相關(guān)，提示AA患者血細(xì)胞端粒長度與疾病的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。②初治SAA患者CD3+T細(xì)胞RAP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于恢復(fù)組和對(duì)照組，考慮與T淋巴細(xì)胞在疾病早期過度增殖有關(guān)。無論CD3+T細(xì)胞還是PWBC在初治組POT1mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著減低，考慮與啟動(dòng)細(xì)胞凋亡相關(guān)。③SAA血清中的TNF-α和IFN-γ成分可通過抑制POT1基因表達(dá)，啟動(dòng)ATR途徑，誘導(dǎo)正常BM