氧化應激調(diào)控基因p66shc對肝細胞衰老的影響及其在非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、研究背景:非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)患病率與日俱增，已成為最常見的慢性肝病之一，它不再是人們傳統(tǒng)觀念中的良性疾病，也可以向終末期肝病進展，因此，對其發(fā)病機制的研究具有重要意義。NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子機制尚未完全明確，最近研究表明細胞衰老與NAFLD密切相關，可能在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。細胞衰老是細胞脫離正常周期不可逆地喪失增殖能力后進入的一種相對穩(wěn)定的狀態(tài)，

2、主要表現(xiàn)在衰老相關β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal)活性的增高、細胞形態(tài)的變化、細胞周期的改變、端?？s短及衰老基因p53、p21、p16等的表達增加，另外細胞在衰老過程中，生物活性因子如粘附因子及炎性因子等分泌增多，這些變化都可能對細胞功能造成影響而導致疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)NAFLD中存在肝細胞衰老現(xiàn)象，表現(xiàn)為過早的端粒縮短、細胞核增大、p21表達增加;且端?？s短

3、、p21表達增加等細胞衰老現(xiàn)象與纖維化程度及疾病進展不良后果肝細胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)等相關。細胞衰老極可能是誘導及促進NAFLD的重要作用分子靶點，對細胞衰老相關機制及分子信號通路的研究為NAFLD的防治提供了重要線索。
　　NAFLD和衰老有著共同的機制-氧化應激，目前認為NAFLD狀態(tài)下，線粒體過度產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)可以促進肝細胞損傷

4、;同時，氧化應激可通過DNA損傷、端粒縮短以及直接調(diào)控衰老相關信號通路等多種途徑引起細胞衰老，可能是導致NAFLD肝細胞衰老的直接原因，但確切機制尚不明確。線粒體銜接蛋白p66shc是Shc家族成員中的一員，是細胞內(nèi)氧化應激的重要調(diào)控者，在線粒體ROS形成中發(fā)揮重要作用，同時，p66shc是一種重要的調(diào)控細胞衰老的蛋白，其在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞及心肌細胞衰老過程中起重要作用，參與了心臟損傷、糖尿病內(nèi)皮細胞功能紊亂及腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。氧化應

5、激調(diào)控基因p66shc是否為調(diào)控肝細胞衰老并參與NAFLD疾病進展的重要原因機制仍有待闡明，對其進行系統(tǒng)的研究有望為NAFLD的防治提供一個新的方法。
　　目的:觀察NAFLD中細胞衰老相關標志物及p66shc的表達，并分析相關性，探討細胞衰老與p66shc的關系及在疾病進展中的作用;進一步敲低及過表達p66shc后，觀察細胞衰老及脂肪變的變化，研究p66shc與細胞衰老的因果關系及對疾病的影響。
　　研究方法:1、選取NA

6、FLD患者外周血標本100例，肝組織標本37例，及正常入外周血標本100例，通過real-time PCR的方法檢測外周血白細胞端粒長度(leucocyte telomere length，LTL)的變化，免疫組化的方法檢測肝組織p21、p66shc的表達，分析細胞衰老指標與p66shc表達的相關性及其與疾病進展的聯(lián)系;
　　2、SD大鼠20只，隨機分為高脂飲食組（10只）和正常對照組（10只），高脂高膽固醇飲食構建NAFLD模型

7、，8周后處死，檢測肝組織p66shc及衰老指標p53、p21、p16、HP1-γ、r-H2A.X、SA-β-gal等的表達，并分析相關性，在NAFLD大鼠模型中進一步探討細胞衰老與p66shc的關系;
　　3、體外培養(yǎng)肝癌細胞株(hepG2)，采用雙氧水誘導細胞衰老模型，檢測p66shc及衰老指標p53、p21、p16、SA-β-gal等的表達及細胞脂肪變的變化，在此基礎上進一步通過慢病毒轉染shRNA敲低p66shc，觀察對衰老

8、指標p21、SA-β-gal及脂肪變的影響;此外，常規(guī)培養(yǎng)人正常肝細胞株（L-02），p66shc過表達質粒轉染L-02細胞后，觀察衰老指標p21、SA-β-gal及細胞脂肪變的變化，在體外研究p66shc與細胞衰老的因果關系及對脂肪變的影響。
　　結果:1、與對照組比較，NAFLD患者LTL明顯縮短，并與肝組織p21表達明顯相關，且兩者與肝臟纖維化程度顯著相關(p＜0.05);進一步分析發(fā)現(xiàn)p21表達及LTL變化與p66shc的

9、表達顯著相關(p＜0.05)，且p66shc與肝組織脂肪變及纖維化顯著相關(p＜0.05)。
　　2、SD大鼠高脂高膽固醇飲食8周可成功構建NAFLD模型，與對照組比較，高脂高膽固醇飲食組大鼠體重明顯增加，血清ALT、AST及血脂等明顯升高，肝臟顯著增大且脂肪變炎癥明顯加重(p＜0.05);NAFLD組大鼠肝組織p66shc及衰老指標p21、p16、HP1-γ、r-H2A.X及SA-β-gal的表達明顯增多(p＜0.05)，且衰老

10、指標與p66shc的表達顯著相關(p＜0.05)。
　　3、雙氧水處理hepG2細胞后可成功誘導衰老模型，與對照組比較，雙氧水處理組衰老指標p21、p16、SA-β-gal的表達明顯增多，且p66shc的表達明顯升高并與衰老指標表達顯著相關，細胞脂肪變程度加重(p＜0.05);進一步慢病毒轉染shRNA敲低p66shc后，p66shc表達明顯降低，且敲低p66shc對雙氧水刺激引起的hepG2細胞衰老有保護作用，與未敲低組比較，衰

11、老指標p21、SA-β-gal的表達明顯降低，同時發(fā)現(xiàn)細胞脂肪變程度減輕(p＜0.05);p66shc過表達質粒轉染組較空載體質粒轉染組，L-02細胞中p66shc表達明顯增多，衰老指標p21及SA-β-gal的表達明顯升高，細胞脂肪變程度加重(p＜0.05)。
　　結論:體內(nèi)實驗證實NAFLD中細胞衰老指標及p66shc表達增高，且兩者具有顯著相關性，提示細胞衰老與p66shc聯(lián)系密切，并可能參與了NAFLD疾病的發(fā)生發(fā)展;體外