p66Shc在砷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用研究.pdf

1、隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的加速發(fā)展，心血管疾病在我國(guó)發(fā)病率逐年升高。心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展是多種危險(xiǎn)因素協(xié)同作用的結(jié)果，砷是環(huán)境中廣泛存在的有毒類金屬之一，通過(guò)氧化應(yīng)激引起心肌損傷，而p66Shc蛋白在細(xì)胞氧化應(yīng)激中有重要作用。本研究探討了p66Shc在亞砷酸鈉介導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用。
　　本研究中，用CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)隨亞砷酸鈉處理濃度的升高(0、5、10、15μM)，心肌細(xì)胞活力呈劑量依賴性降低。用Hoechst33

2、258染料檢測(cè)細(xì)胞凋亡小體，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞隨亞砷酸鈉處理濃度的升高凋亡率呈劑量依賴性升高。雙氯熒光素探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨亞砷酸鈉處理濃度的升高呈劑量依賴性升高。研究提示亞砷酸鈉可能通過(guò)氧化損傷誘導(dǎo)心肌細(xì)胞活力降低，凋亡率升高。
　　氧化應(yīng)激信號(hào)通過(guò)p66Shc發(fā)生磷酸化等一系列生理過(guò)程，調(diào)控其從胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體和細(xì)胞核，促進(jìn)ROS的發(fā)生。用5μM亞砷酸鈉處理心肌細(xì)胞后，Western蛋白免疫印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p66Shc表

3、達(dá)量和絲氨酸36位磷酸化p66Shc水平顯著性增加，磷酸化p66Shc與總p66Shc的比值也顯著性升高。亞砷酸鈉處理心肌細(xì)胞后，通過(guò)免疫熒光染色p66Shc，并用Mito Tracker標(biāo)記線粒體以及DAPI復(fù)染細(xì)胞核，進(jìn)行免疫熒光共聚焦檢測(cè)，結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)p66Shc熒光信號(hào)明顯升高，部分p66Shc從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位到線粒體，部分p66Shc進(jìn)入細(xì)胞核。這些結(jié)果表明亞砷酸鈉上調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)p66Shc的表達(dá)和磷酸化水平，改變p66Shc在

4、胞內(nèi)的亞細(xì)胞分布定位。
　　為了進(jìn)一步確認(rèn)p66Shc在亞砷酸鈉誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的作用，進(jìn)行了siRNA敲低和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。利用p66Shc特異性敲低siRNA(si-p66Shc)轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，Western檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染si-p66Shc特異性降低p66Shc蛋白表達(dá)。DCFH-DA檢測(cè)表明，當(dāng)敲低心肌細(xì)胞內(nèi)的p66Shc時(shí)，亞砷酸鈉引起的ROS水平與對(duì)照組相比顯著降低。構(gòu)建p66Shc野生型和突變型p66ShcSe

5、r36Ala真核表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后進(jìn)行亞砷酸鈉處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)野生型p66Shc質(zhì)粒顯著增加亞砷酸鈉引起的胞內(nèi)ROS水平升高，而過(guò)表達(dá)突變型p66ShcSer36Ala質(zhì)粒顯著降低胞內(nèi)ROS水平。這些結(jié)果表明p66Shc介導(dǎo)亞砷酸鈉誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ROS水平的升高。
　　p66Shc通過(guò)直接轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a相互作用，也可以通過(guò)AKT磷酸化FOXO3a促進(jìn)其磷酸化，抑制轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制

6、相關(guān)抗氧化酶基因的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平。進(jìn)一步檢測(cè)了AKT和FOXO3a的磷酸化水平，結(jié)果表明亞砷酸鈉處理后，AKT第473位絲氨酸發(fā)生磷酸化，磷酸化AKT與總AKT的比值顯著性升高;同時(shí)FOXO3a第253位絲氨酸磷酸化水平也增加。這些結(jié)果提示亞砷酸鈉可能通過(guò)p66Shc轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核以及磷酸化AKT兩種途徑磷酸化FOXO3a，抑制抗氧化酶基因的表達(dá)。
　　綜上所述，亞砷酸鈉通過(guò)上調(diào)心肌細(xì)胞p66Shc表達(dá)和磷酸化，引起p