H-FABP死后診斷早期心肌梗死的免疫組化實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、SCD的研究是法醫(yī)病理學(xué)重要的任務(wù)之一，而AMI的死后診斷是法醫(yī)病理學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。不足6h的心肌梗死死亡病例，其心肌在肉眼和光學(xué)顯微鏡下無特異性的改變，不使用特殊方法，難以對(duì)AMI引起的猝死作出早期的組織學(xué)診斷。在常規(guī)的組織學(xué)染色出現(xiàn)特征性的形態(tài)學(xué)改變以前，缺血心肌已經(jīng)發(fā)生了一系列的病理生理變化。生物化學(xué)，組織化學(xué)、酶組織化學(xué)、熒光組織化學(xué)染色，電子顯微鏡技術(shù)都能顯示心肌的早期損害，但是上述方法因操作過于復(fù)雜，缺乏特異性、穩(wěn)定性，費(fèi)用

2、過高，以及易受到組織自溶、腐敗等因素的影響而限制了它們?cè)诜ㄡt(yī)學(xué)中的應(yīng)用。IHC作為一項(xiàng)快捷、簡便、實(shí)用的方法，它可以顯示缺血心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)和量的變化，從而為AMI死后診斷提供了一種可能。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白是一種小分子蛋白質(zhì)((14-15kDa)，且有嚴(yán)格的器官特異性，大量地存在于心肌細(xì)胞漿中，其作用是上調(diào)心肌細(xì)胞中的長鏈脂肪酸。具有分子量小、心肌細(xì)胞中含量高且為水溶性的特點(diǎn)，當(dāng)心肌細(xì)胞缺血時(shí)，心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)很

3、容易迅速地透過細(xì)胞膜而漏出到細(xì)胞間質(zhì)，從而進(jìn)入血液循環(huán)。大量的臨床研究證實(shí)心肌缺血12小時(shí)內(nèi)，用血液中脂肪酸結(jié)合蛋白的濃度診斷心肌梗死在特異性和敏感性方面都優(yōu)于肌紅蛋白，原因主要是脂肪酸結(jié)合蛋白的分子量較肌紅蛋白 (18kDa)小且有心臟特異性。因此心肌脂肪酸結(jié)合蛋白目前被世界衛(wèi)生組織列為新推薦的診斷急性心肌梗死的早期指標(biāo)之一。用于心肌缺血引起猝死的死后診斷的IHC指標(biāo)能否用于法醫(yī)病理學(xué)診斷，需要考慮其特異性和敏感性以外，還必須考慮組織

4、自溶、腐敗等因素對(duì)抗原的影響。因此用于心肌缺血引起猝死的死后診斷的各種IHC指標(biāo)的死后穩(wěn)定性及其在死后不同時(shí)間的表達(dá)變化規(guī)律是值得進(jìn)一步研究。 目的：本研究利用結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立動(dòng)物心肌缺血模型，運(yùn)用免疫組化的方法，探討H-FABP在死后診斷早期心肌梗死的敏感性及死后穩(wěn)定性，以期對(duì)其在法醫(yī)學(xué)中診斷SCD的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)。 實(shí)驗(yàn)分為兩部分： 一.H-FABP在缺血心肌中的表達(dá)及敏感性研究方法：結(jié)扎大

5、鼠左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立大鼠心肌缺血模型，檢測H-FABP在大鼠心肌缺血不同時(shí)間的表達(dá)。45只健康SD大白鼠，重250-300克，雌雄不限，隨機(jī)分為8個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組5只。對(duì)照組大白鼠除不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈外，其它步驟與實(shí)驗(yàn)組完全相同。各實(shí)驗(yàn)組大白鼠分別于結(jié)扎后15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)后處死，對(duì)照組大白鼠于手術(shù)后0小時(shí)處死.取出心臟放入10％中性緩沖福爾馬林液中固定24h。取材后作HE

6、染色和H-FABP免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察兩組標(biāo)本的HE、IHC切片；并按IHC染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)IHC染色進(jìn)行全面的觀察、判斷，采用圖像分析技術(shù)，客觀測量IHC切片中H-FABP的缺失面積和陽性面積。結(jié)果： 1.常規(guī)HE染色：對(duì)照組及心肌缺血3h以內(nèi)組，心肌細(xì)胞染色清晰、邊界清楚、橫紋存在，僅見有輕度心肌間質(zhì)水腫。心肌缺血4h后缺血區(qū)可見少許心肌細(xì)胞輕度水腫，缺血區(qū)邊緣有少許炎性細(xì)胞浸潤、心肌嗜伊紅性增強(qiáng)，未見明顯的細(xì)胞

7、壞死。心肌缺血8h可見心肌嗜伊紅性明顯增強(qiáng)，部分心肌細(xì)胞出現(xiàn)凝固性壞死，炎性細(xì)胞增多。 2.免疫組織化學(xué)染色：對(duì)照組心肌胞漿全部染成均勻的棕黃色，用蘇木素襯染后，細(xì)胞核染成淡藍(lán)色，心肌細(xì)胞間質(zhì)及其他細(xì)胞成分不著色。實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞H-FABP在缺血心肌內(nèi)的脫失表達(dá)具有明顯的時(shí)間規(guī)律。缺血15分鐘組，在心內(nèi)膜下心肌、乳頭肌可見散在或小灶性的部分H-FABP缺失。缺血30分鐘組，開始出現(xiàn)脂肪酸結(jié)合蛋白的完全脫失，但仍然局限于心肌內(nèi)膜下

8、和乳頭肌。缺血1小時(shí)和2小時(shí)組的心肌則出現(xiàn)斑片狀缺失且波及到心肌中層，缺血3小時(shí)累及心肌外層。缺血4小時(shí)，心肌細(xì)胞則出現(xiàn)全層細(xì)胞的完全脫失并隨著缺血時(shí)間的延長，脫失面積增大。H-FABP在心肌缺血不同時(shí)間的各組缺失面積經(jīng)比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：實(shí)驗(yàn)組的H-FABP缺失面積與其各相應(yīng)對(duì)照組比較均有顯著性差異，H-FABP在缺血3小時(shí)內(nèi)各組之間沒有明顯的差異性，而心肌缺血3小時(shí)與心肌缺血4小時(shí)的心肌細(xì)胞中H-FABP脫失面積仍有顯著差異，說明

9、H-FABP的敏感性主要體現(xiàn)在心肌缺血3h以前。 二.H-FABP在診斷早期心肌梗死的死后穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)性 研究方法：結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立家兔心肌梗死3小時(shí)模型，檢測H-FABP在死后不同時(shí)間的表達(dá)情況。20只健康新西蘭大白兔，體重2-2.5kg，雌雄不限，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(B組n=10)和對(duì)照組(A組n=10)。實(shí)驗(yàn)組予以結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支造成心肌缺血持續(xù)3小時(shí)后斷頸處死，取缺血區(qū)心?。粚?duì)照組除不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈

10、外，其它步驟與實(shí)驗(yàn)組完全相同。術(shù)后0時(shí)直接處死，取左心室心肌。兩組標(biāo)本在4℃放置，分別于死后1h、2h、4h、8h、16h、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、10d、2w、取材作HE染色和H-FABP免疫組化染色。觀察兩組標(biāo)本的HE切片；并按IHC染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)IHC染色進(jìn)行全面的觀察、判斷，采用圖像分析技術(shù)，客觀測量IHC切片中H-FABP的缺失面積和陽性表達(dá)強(qiáng)度。 結(jié)果： 1.常規(guī)HE染色：缺血心肌組織可

11、見細(xì)胞濁腫、水樣變，橫紋模糊或消失，胞漿灶性嗜伊紅性增強(qiáng)、胞核縮小而染色加深，心肌纖維波浪樣改變等心肌早期缺血的病理改變，未見典型心肌梗死改變。缺血心肌4℃放置3-4天，心肌結(jié)構(gòu)部分改變?nèi)缧募〖?xì)胞濁腫、橫紋模糊或消失與正常心肌死后變化相似，缺乏特異性。放置7-14天，缺血心肌組織和細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組類似。 2.免疫組織化學(xué)染色：對(duì)照組心肌組織在4℃放置3d內(nèi)，H-FABP在心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)呈強(qiáng)陽性表達(dá)，未見明顯的脫失區(qū)；4℃放置4d

12、心肌內(nèi)膜下出現(xiàn)部分小片狀缺失。缺血區(qū)心肌組織均可見不規(guī)則點(diǎn)、灶、片狀H-FABP缺失區(qū)；部分區(qū)域心肌細(xì)胞H-FABP陽性表達(dá)強(qiáng)度減弱。連續(xù)HE染色對(duì)比發(fā)現(xiàn)H-FABP缺失區(qū)及陽性表達(dá)減弱區(qū)的心肌細(xì)胞胞漿嗜伊紅性增強(qiáng)、細(xì)胞核縮小而染色加深。梗死區(qū)與非梗死交界區(qū)域的心肌細(xì)胞內(nèi)H-FABP陽性表達(dá)強(qiáng)度減弱與周圍陽性表達(dá)的非缺血區(qū)心肌分界清楚。H-FABP在在對(duì)照組及心肌梗死組不同時(shí)間的缺失面積兩兩比較和統(tǒng)計(jì)分析表明：4℃放置3d內(nèi)H-FABP

13、陽性表達(dá)強(qiáng)度無明顯減弱，缺失面積無增加；隨著兩組標(biāo)本在4℃放置時(shí)間的延長，H-FABP陽性表達(dá)強(qiáng)度和陽性反應(yīng)面積有減弱趨勢。死后放置4d以內(nèi)H-FABP脫失面積與相應(yīng)正常對(duì)照組有顯著性差異(p＜0.05)，放置超過5d以上，其脫失面積與正常對(duì)照組無顯著性差異(p＞0.05)。結(jié)論： 1.大鼠心肌缺血后15min即可出現(xiàn)H-FABP脫失，隨著缺血時(shí)間的延長，心肌細(xì)胞內(nèi)H-FABP的缺失面積增加，心肌缺血4小時(shí)達(dá)到高峰。H-FABP