蛋白激酶CK2α′亞基相互作用蛋白的篩選及相關(guān)深入研究.pdf

1、蛋白激酶CK2是一種真核細(xì)胞中普遍存在的信使非依賴(lài)性絲/蘇氨酸蛋白激酶。CK2是由兩個(gè)催化亞基(α和α’)和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基(β)組成的異四聚體(α2β2.αα'β2或α’2β2)。它參與廣泛的細(xì)胞正常功能的調(diào)控，如基因表達(dá)，蛋白合成，細(xì)胞周期，細(xì)胞生長(zhǎng)及分化，同時(shí)還參與如癌癥發(fā)生，抗凋亡等病理過(guò)程。2003年已報(bào)道CK2有多達(dá)307種作用底物，其中243種得到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確證，許多新的CK2底物還在不斷地被發(fā)現(xiàn)。CK2在睪丸及腦組織中活性最高

2、，睪丸組織中CK2α'亞基水平是腦組織的兩倍；CK2β亞基比腦組織高3～4倍，比其它組織高將近8～10倍。因此本研究擬從人睪丸cDNA文庫(kù)中，利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與蛋白激酶CK2α'亞基相互作用的蛋白。 方法：構(gòu)建于pACT2質(zhì)粒(酵母雙雜交中的AD質(zhì)粒)的人睪丸cDNA文庫(kù)和本室已成功構(gòu)建的BD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染感受態(tài)酵母菌AH109后得到的初篩候選陽(yáng)性克隆，從這些候選克隆中，通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109獲得單一文庫(kù)質(zhì)粒，再進(jìn)行自主

3、激活報(bào)告基因檢測(cè)和一對(duì)一回復(fù)性雜交實(shí)驗(yàn)，最后篩選出真陽(yáng)性克隆(即與人蛋白激酶CK2α'相互作用的蛋白)。經(jīng)上述一對(duì)一回復(fù)確證為陽(yáng)性相互作用的AD質(zhì)粒。以pACT2質(zhì)粒的通用引物為測(cè)序引物測(cè)定該質(zhì)粒的插入片段cDNA序列。通過(guò)國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，以美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)的BLAST作為主要的檢索工具，檢索主要程序采用BLAST，對(duì)相互作用蛋白的cDNA序列進(jìn)行同源性分析，最終確定該相互作用蛋白的名稱(chēng)。通過(guò)原核表達(dá)獲得陽(yáng)性克隆蛋白，用以

4、進(jìn)一步證實(shí)CK2α'與陽(yáng)性克隆蛋白間的相互作用。 結(jié)果：(1)經(jīng)過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，篩選出10種與蛋白激酶CK2α'相互作用蛋白，核酸序列分析及同源性檢索結(jié)果為：①人CK2β亞基；②人COP9組成性光形成性同源亞基5；③人基質(zhì)蛋白3；④人核酸酶敏感元件結(jié)合蛋白1；⑤人核轉(zhuǎn)換蛋白1；⑥人9KD1癌癥/睪丸相關(guān)蛋白；⑦人線(xiàn)粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅲ；⑧人依莫帕米結(jié)合蛋白(異構(gòu)酶)以及兩個(gè)未知功能蛋白。(2)人9kD癌癥/睪丸相關(guān)蛋白的原核