轉(zhuǎn)移相關(guān)基因ABCE1編碼蛋白的相互作用蛋白篩選及鑒定.pdf

1、目的：
　　肺癌是人類病死率最高的惡性腫瘤，而轉(zhuǎn)移正是導(dǎo)致肺癌較高死亡率的重要因素，因此篩選新的肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并探討其在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，尋找潛在的靶向治療基因?qū)τ诎l(fā)現(xiàn)肺癌新的治療方法有著重要的意義。
　　ABCE1（ATP-bindng cassette transporter E1，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子E1）基因?qū)貯TP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子基因亞家族，又稱核糖核酸酶L(RNase L)抑制因子。ABCE1基因能夠通過特

2、異性抑制RNase來阻斷2-5A/RNase L通路，對細胞抗病毒、細胞增殖、抗凋亡，并可能在某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著特定的作用。而且在促進蛋白質(zhì)合成及細胞增殖分化過程中發(fā)揮著作用。
　　在本課題前期研究工作中，首先應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)及激光俘獲顯微切割技術(shù)（Laser Capture Microdissection，LCM）在手術(shù)切除的小細胞肺癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中篩選出的差異性基因片段，應(yīng)用BLAST軟件與Genb

3、ank進行對比發(fā)現(xiàn)該基因片段與人4號染色體上的ABCE1基因的序列一致性為95％。前期研究表明ABCE1 mRNA和蛋白在肺癌和癌旁組織中的表達存在顯著差異。體外實驗中應(yīng)用RNAi干擾技術(shù)下調(diào)ABCE1基因表達，明顯降低肺癌細胞的遷移與侵襲能力的同時，若干肺癌相關(guān)基因的表達也隨之發(fā)生變化。以上結(jié)果表明，ABCE1可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有必要對ABCE1基因在肺癌中的作用進行更深入的研究。
　　蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用已經(jīng)成為

4、后基因組生物學(xué)的中心問題。在人體內(nèi)，信息流過程受損或者是信息通信失控可能會引起疾病，對蛋白質(zhì)復(fù)合物以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究，有助于在分子水平上重新構(gòu)建疾病相關(guān)的信號傳輸通道，并尋找治療干預(yù)的新靶點。
　　因此本研究首先體外誘導(dǎo)表達ABCE1重組蛋白，其次以該蛋白為誘餌篩選ABCE1相互作用蛋白，最后初步探討ABCE1及其相互作用蛋白對肺癌侵襲及轉(zhuǎn)移的影響，為肺癌侵襲轉(zhuǎn)移提出新的可能機制。
　　方法：
　　一、通

5、過基因克隆技術(shù)構(gòu)建GST（Glutathione-S-Transferase，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶）標簽融合ABCE1基因的原核表達載體(pGEX-4T-1-ABCE1)。通過轉(zhuǎn)化技術(shù)，在E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)GST-ABCE1重組融合蛋白表達。
　　二、以GST-ABCE1重組蛋白為誘餌蛋白，以GST蛋白及空樹脂為對照，應(yīng)用GST pull-down技術(shù)在肺腺癌LTEP-a-2細胞株蛋白裂解液上清中篩選相互作用蛋

6、白，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定ABCE1的相互作用蛋白。然后應(yīng)用免疫共沉淀(Co-Immunopreeipitation，Co-Ip)和免疫熒光共定位分析驗證篩選結(jié)果。免疫共沉淀:通過結(jié)合Anti-ABCE1抗體的樹脂對肺腺癌LTEP-a-2細胞株中內(nèi)源性ABCE1及其相互作用蛋白的免疫復(fù)合物進行免疫共沉淀，以Pierce公司試劑盒提供的對照樹脂及空樹脂為對照，以相互作用蛋白的抗體行Western blot檢測。免疫熒光共定位分析:以真核表達載體p

7、EGFP-C1-ABCE1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肺腺癌LTEP-a-2細胞株為實驗組，空載體pEGFP-C1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肺腺癌LTEP-a-2細胞株及LTEP-a-2細胞株為對照組，利用不同種屬來源的熒光二抗進行免疫熒光雙標一抗，在激光共聚焦顯微鏡下觀察ABCE1及其相互作用蛋白在細胞體內(nèi)是否存在共定位現(xiàn)象。
　　三、以真核表達載體pEGFP-C1-ABCE1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肺腺癌LTEP-a-2細胞株為實驗組，空載體pEGFP-C1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肺腺癌

8、LTEP-a-2細胞株和LTEP-a-2細胞株為對照組，進行以下實驗:Western blot的方法檢測ABCE1上調(diào)對互作蛋白表達的影響;利用Transwell細胞體外侵襲實驗，檢測ABCE1表達上調(diào)對肺腺癌LTEP-a-2細胞遷移、侵襲能力的影響;通過鬼筆環(huán)肽(phalloidin)標記F-actin，應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察ABCE1表達上調(diào)對細胞微絲結(jié)構(gòu)的影響。
　　結(jié)果：
　　一、ABCE1基因編碼序列已被克隆至GST

9、融合表達載體pGEX-4T-1，經(jīng)酶切和DNA測序驗證序列正確，并在E.coli BL21(DE3)中獲得了誘導(dǎo)表達，分子量(94KD)與理論大小基本一致。
　　一、應(yīng)用GST pull-down結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，篩選出ABCE1相互作用蛋白:β-肌動蛋白。在免疫共沉淀實驗中，實驗組經(jīng)Western blot檢測到β-肌動蛋白的條帶，而在對照組中未檢測到β-肌動蛋白的條帶。在免疫熒光共定位分析中，應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀測到ABCE1蛋

10、白與肌動蛋白在胞漿中存在共定位現(xiàn)象，而且ABCE1蛋白表達量上調(diào)后，β-肌動蛋白蛋白表達量上調(diào)。
　　三、實驗組中β-肌動蛋白蛋白表達量高于對照組。Transwell細胞體外侵襲實驗發(fā)現(xiàn)實驗組的肺腺癌LTEP-a-2細胞穿膜細胞數(shù)較對照組穿膜細胞數(shù)顯著增多。在實驗組中，肌動蛋白表達增強，均勻分布于胞漿，微絲骨架結(jié)構(gòu)排列紊亂，質(zhì)膜外側(cè)微刺結(jié)構(gòu)增多。而在對照組中，肌動蛋白更集中分布于細胞質(zhì)膜，微絲骨架排列較為規(guī)則，質(zhì)膜外側(cè)微刺結(jié)構(gòu)明顯

11、減少。在各組細胞鋪板后24小時觀察時，對照組中微絲排列比實驗組規(guī)整，但是在48小時觀察時，對照組中微絲排列較24小時更為規(guī)整，但是實驗組中微絲的排列更加紊亂。
　　結(jié)論：
　　一、重組GST-ABCE1蛋白能夠在原核表達系統(tǒng)中成功表達，為進一步研究打下基礎(chǔ)。
　　二、ABCE1與β-肌動蛋白有相互作用關(guān)系。上調(diào)ABCE1蛋白表達能促使β-肌動蛋白的蛋白表達量增多。
　　三、ABCE1基因可能是通過促使β-肌動蛋白