耐輻射奇球菌特有蛋白PprI的相互作用蛋白篩選.pdf

1、背景與目的：耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans，簡稱DR)是一種對電離輻射、紫外線、強(qiáng)氧化劑和化學(xué)誘變劑等均具有超強(qiáng)耐受力的極端微生物。DR菌的pprI突變株研究發(fā)現(xiàn)，pprI的缺失導(dǎo)致DR菌抗輻射能力顯著降低，而pprI補(bǔ)償株的輻射抗性得到完全恢復(fù)，提示pprI基因在耐輻射球菌的極端抗性中起重要作用。本研究將利用酵母雙雜交及免疫共沉淀技術(shù)篩選并鑒定與 PprI相互作用的蛋白質(zhì)，試圖了解以 PprI為核心的復(fù)雜

2、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)組成，為進(jìn)一步明確DR菌輻射損傷的高效修復(fù)原理、探究DR菌耐輻射的分子機(jī)制做鋪墊。
　　方法：構(gòu)建釣餌載體pGBKT7–pprI，將pGBKT7–pprI與pGADT7共轉(zhuǎn)化入酵母菌AH109中，分析其表達(dá)產(chǎn)物是否影響酵母菌的生長以及能否自激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。在本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建好的兩種耐輻射奇球菌基因組文庫(pGADT7–DNADR/Sau3AI和pGADT7–DNADR/HpaII)基礎(chǔ)上，應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)從DR菌基因組

3、表達(dá)文庫中篩選可能與PprI相互作用的蛋白。篩選得到的蛋白質(zhì)和PprI在酵母菌AH109內(nèi)免疫共沉淀進(jìn)一步驗(yàn)證。應(yīng)用CDD和SMART在線軟件分別對篩選得到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域分析及對PprI和SCS的蛋白相互作用鏈預(yù)測。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體 pGBKT7–pprI，通過檢測發(fā)現(xiàn)其沒有自激活作用并且對酵母菌 AH109無毒性作用，Western blot法證實(shí)轉(zhuǎn)化的酵母AH109菌株能夠正確表達(dá) Myc-PprI融合蛋

4、白；利用酵母雙雜交成功篩選到10個(gè)藍(lán)色陽性克隆；免疫共沉淀結(jié)果顯示，SCS（Succinyl CoA synthetase）蛋白可以在Myc抗體的免疫沉淀物中檢測出來，同樣在HA抗體的免疫沉淀物中也能分別檢測到蛋白PprI；生物信息學(xué)分析表明篩選得到的10個(gè)蛋白質(zhì)中有4個(gè)蛋白具有共同的NADB結(jié)構(gòu)域。
　　結(jié)論：
　　(1)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7–pprI和pGADT7–pprI，經(jīng)自激活活性檢測提示pGBKT7–pp