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1、蛋白激發(fā)子是一類(lèi)能激發(fā)植物防御反應(yīng)基因表達(dá)與過(guò)敏性反應(yīng)的特殊信號(hào)蛋白活性物質(zhì)。本論文以細(xì)極鏈格孢菌 (Alternaria tenuissima) 的cDNA入門(mén)文庫(kù)和實(shí)驗(yàn)室自制的蛋白激發(fā)子抗體為材料,構(gòu)建了細(xì)極鏈格孢菌的cDNA表達(dá)文庫(kù);免疫篩選表達(dá)文庫(kù),獲得了9個(gè)陽(yáng)性克隆子;選擇其中一個(gè)克隆構(gòu)建了該基因的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),獲得了具有激發(fā)子功能的分泌表達(dá)蛋ca;利用酵母雙雜交技術(shù),篩選番茄cDNA文庫(kù),獲得了該基因編碼蛋白的互作蛋白并
2、分析了可能的互作蛋白的功能。主要研究結(jié)果如下: 1、構(gòu)建了細(xì)極鏈格孢菌的cDNA表達(dá)文庫(kù)。利用Gateway技術(shù),在重組酶的作用下把細(xì)極鏈格孢菌的cDNA入門(mén)文庫(kù)轉(zhuǎn)換為表達(dá)cDNA文庫(kù);以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌,利用IPTG誘導(dǎo)含cDNA表達(dá)文庫(kù)質(zhì)粒的外源基因的蛋白表達(dá); 2、用激活蛋白抗體,免疫篩選表達(dá)文庫(kù)克隆,獲得了9個(gè)陽(yáng)性克隆子。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,并在G-cnBank中進(jìn)行Blast檢索,發(fā)現(xiàn)其中五個(gè)
3、克隆和數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因有同源性,而其它四個(gè)克隆沒(méi)有同源性;這五個(gè)基因中,一個(gè)與甲酸脫氫酶蛋白(NAD-dependent formatedehydrogenase AciA/Fdh)具有89%的同源性:另外一個(gè)與 D-木酮糖/D-果糖磷酸解酮酶(D-xylulosc 5-phospbate/D-fructose 6-phosphate phosphoketolase)具有73%的同源性;還有三個(gè)陽(yáng)性克隆序列相同,并與編碼Prohibiti
4、n的基因同源性達(dá)76%;序列分析發(fā)現(xiàn),這三個(gè)相同的陽(yáng)性克隆的DNA片段中含有完整的開(kāi)放閱讀框架,將該基因命名為peaT2(Protein Elicitorfrom Alternaria tenuissima2),進(jìn)行了GenBank登錄(GenBank登錄號(hào)為EF212880)。 3、構(gòu)建了peaT2基因畢赤酵母表達(dá)載體,獲得了具有生物活性的分泌表達(dá)蛋白。用PCR法從細(xì)極鏈格孢菌DNA中擴(kuò)增獲得peaT2基因的編碼序列并亞克隆到
5、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體pPIC9K 上,得到重組質(zhì)粒pPIC9K/peaT2。重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I線性化后用電穿孔法導(dǎo)入到畢赤酵母(Pichia pastoris) GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法篩選Mut<'+>表型,獲得了分泌表達(dá)的重組畢赤酵母菌株。隨機(jī)挑取一重組菌株作為表達(dá)菌,用甲醇誘導(dǎo)PeaT2蛋白表達(dá),SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)結(jié)果均表明,peaT2基因在畢赤酵母中成功地分泌表達(dá)
6、。生物測(cè)定表明,表達(dá)蛋白PeaT2能明顯促進(jìn)小麥的生長(zhǎng),具有蛋白激發(fā)子功能。 4、利用酵母雙雜交技術(shù),篩選番茄cDNA文庫(kù)獲得了Pealr2蛋白的互作蛋白。構(gòu)建以peaT2基因?yàn)椤罢T餌蛋白”的重組載體,驗(yàn)證沒(méi)有自激活作用后,利用順序轉(zhuǎn)化法把番茄文庫(kù)轉(zhuǎn)化入含peaT2基因重組載體的EGY48[p8op-lacZ]酵母感受態(tài)中,挑取顯藍(lán)色的克隆子;提取AD質(zhì)粒,并進(jìn)行AD與“誘餌”載體的一對(duì)一再次驗(yàn)證;最后獲得了5個(gè)陽(yáng)性克隆子。
7、 5、對(duì)這些陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定和比對(duì)分析表明,在5個(gè)陽(yáng)性克隆子中,一個(gè)是番茄的鐵氧還原蛋白(ferredoxin-I);一個(gè)與擬南芥的ATe酶(AVA-P2、ATPase)具有99%的同源性,一個(gè)是未知功能的基因;一個(gè)與馬鈴薯的40S核糖體蛋白(40S ribosomal protein)具有99%的同源性,一個(gè)與煙草的RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein)具有92%的同源性。推測(cè)PeaT2蛋白可能在植物的葉片上
8、有受體位點(diǎn)。 6、進(jìn)行了peaT2基因的原核表達(dá),為噬菌體展示系統(tǒng)研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。為了深入研究peaT2基因的功能結(jié)構(gòu)域,選用原核表達(dá)系統(tǒng)中的pET-28a(+)為表達(dá)載體,并把重組載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌BL21(DE3),通過(guò)IPTG誘導(dǎo)外源基因的表達(dá);PeaT2蛋白獲得了表達(dá),并利用AKTA系統(tǒng)的親和柱HiTtap Chelating(Amersham)純化PEAl2蛋白。純化的PeaT2蛋白為噬菌體展示系統(tǒng)提供了實(shí)驗(yàn)材料。
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