細(xì)極鏈格孢菌蛋白激發(fā)子PeaT2的基因克隆及互作蛋白的研究.pdf

1、蛋白激發(fā)子是一類能激發(fā)植物防御反應(yīng)基因表達(dá)與過敏性反應(yīng)的特殊信號蛋白活性物質(zhì)。本論文以細(xì)極鏈格孢菌 (Alternaria tenuissima) 的cDNA入門文庫和實(shí)驗(yàn)室自制的蛋白激發(fā)子抗體為材料，構(gòu)建了細(xì)極鏈格孢菌的cDNA表達(dá)文庫；免疫篩選表達(dá)文庫，獲得了9個(gè)陽性克隆子；選擇其中一個(gè)克隆構(gòu)建了該基因的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，獲得了具有激發(fā)子功能的分泌表達(dá)蛋ca；利用酵母雙雜交技術(shù)，篩選番茄cDNA文庫，獲得了該基因編碼蛋白的互作蛋白并

2、分析了可能的互作蛋白的功能。主要研究結(jié)果如下： 1、構(gòu)建了細(xì)極鏈格孢菌的cDNA表達(dá)文庫。利用Gateway技術(shù)，在重組酶的作用下把細(xì)極鏈格孢菌的cDNA入門文庫轉(zhuǎn)換為表達(dá)cDNA文庫；以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌，利用IPTG誘導(dǎo)含cDNA表達(dá)文庫質(zhì)粒的外源基因的蛋白表達(dá)； 2、用激活蛋白抗體，免疫篩選表達(dá)文庫克隆，獲得了9個(gè)陽性克隆子。對陽性克隆進(jìn)行測序，并在G-cnBank中進(jìn)行Blast檢索，發(fā)現(xiàn)其中五個(gè)

3、克隆和數(shù)據(jù)庫中的基因有同源性，而其它四個(gè)克隆沒有同源性；這五個(gè)基因中，一個(gè)與甲酸脫氫酶蛋白(NAD-dependent formatedehydrogenase AciA/Fdh)具有89％的同源性：另外一個(gè)與 D-木酮糖/D-果糖磷酸解酮酶(D-xylulosc 5-phospbate/D-fructose 6-phosphate phosphoketolase)具有73％的同源性；還有三個(gè)陽性克隆序列相同，并與編碼Prohibiti

4、n的基因同源性達(dá)76％；序列分析發(fā)現(xiàn)，這三個(gè)相同的陽性克隆的DNA片段中含有完整的開放閱讀框架，將該基因命名為peaT2(Protein Elicitorfrom Alternaria tenuissima2)，進(jìn)行了GenBank登錄(GenBank登錄號為EF212880)。 3、構(gòu)建了peaT2基因畢赤酵母表達(dá)載體，獲得了具有生物活性的分泌表達(dá)蛋白。用PCR法從細(xì)極鏈格孢菌DNA中擴(kuò)增獲得peaT2基因的編碼序列并亞克隆到

5、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體pPIC9K 上，得到重組質(zhì)粒pPIC9K/peaT2。重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I線性化后用電穿孔法導(dǎo)入到畢赤酵母(Pichia pastoris) GS115中，采用MD、G418-YPD平板和PCR法篩選Mut<'+>表型，獲得了分泌表達(dá)的重組畢赤酵母菌株。隨機(jī)挑取一重組菌株作為表達(dá)菌，用甲醇誘導(dǎo)PeaT2蛋白表達(dá)，SDS-PAGE及Western blot檢測結(jié)果均表明，peaT2基因在畢赤酵母中成功地分泌表達(dá)

6、。生物測定表明，表達(dá)蛋白PeaT2能明顯促進(jìn)小麥的生長，具有蛋白激發(fā)子功能。 4、利用酵母雙雜交技術(shù)，篩選番茄cDNA文庫獲得了Pealr2蛋白的互作蛋白。構(gòu)建以peaT2基因?yàn)椤罢T餌蛋白”的重組載體，驗(yàn)證沒有自激活作用后，利用順序轉(zhuǎn)化法把番茄文庫轉(zhuǎn)化入含peaT2基因重組載體的EGY48[p8op-lacZ]酵母感受態(tài)中，挑取顯藍(lán)色的克隆子；提取AD質(zhì)粒，并進(jìn)行AD與“誘餌”載體的一對一再次驗(yàn)證；最后獲得了5個(gè)陽性克隆子。

7、 5、對這些陽性克隆進(jìn)行序列測定和比對分析表明，在5個(gè)陽性克隆子中，一個(gè)是番茄的鐵氧還原蛋白(ferredoxin-I)；一個(gè)與擬南芥的ATe酶(AVA-P2、ATPase)具有99％的同源性，一個(gè)是未知功能的基因；一個(gè)與馬鈴薯的40S核糖體蛋白(40S ribosomal protein)具有99％的同源性，一個(gè)與煙草的RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein)具有92％的同源性。推測PeaT2蛋白可能在植物的葉片上

8、有受體位點(diǎn)。 6、進(jìn)行了peaT2基因的原核表達(dá)，為噬菌體展示系統(tǒng)研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。為了深入研究peaT2基因的功能結(jié)構(gòu)域，選用原核表達(dá)系統(tǒng)中的pET-28a(+)為表達(dá)載體，并把重組載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，通過IPTG誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)；PeaT2蛋白獲得了表達(dá)，并利用AKTA系統(tǒng)的親和柱HiTtap Chelating(Amersham)純化PEAl2蛋白。純化的PeaT2蛋白為噬菌體展示系統(tǒng)提供了實(shí)驗(yàn)材料。