栗疫菌蛋白激發(fā)子PECp1基因克隆表達與功能分析.pdf

1、板栗是四大堅果之一，具有重要的經濟價值和營養(yǎng)價值。板栗在我國適應性強，分布范圍廣泛，具有重要的生態(tài)價值，也是貧困山區(qū)脫貧致富的重要樹種。板栗疫病的發(fā)生阻礙了板栗的增收增產，嚴重時造成全株死亡。蛋白激發(fā)子能夠引發(fā)植物的免疫反應，增強植物的抗逆能力，在植物抗病害過程中起著重要作用，目前關于板栗疫病蛋白激發(fā)子的研究還未見報道。本文以板栗疫病為研究對象，通過與已知蛋白激發(fā)子進行同源性比對，進行栗疫菌蛋白激發(fā)子PECp1(Proteinelici

2、tor of Cryphonectria parasitica1)片段的克隆，并進行原核表達，優(yōu)化其表達條件，并將表達出的蛋白作用于植物種子和幼苗，分析了栗疫菌蛋白激發(fā)子的結構，同時也為深入研究該蛋白的功能奠定了理論基礎，本研究取得的主要成果如下:
　　1.栗疫菌蛋白激發(fā)子PECp1的基因克隆:通過與已知的蛋白激發(fā)子進行同源性比對，采用同源克隆，擴增出PECp1的DNA片段，通過RT-PCR擴增出PECp1的cDNA片段，將DNA

3、和cDNA序列進行比對，PECp1的DNA全長824bp，包含兩段總長為204bp的內含子，PECp1的cDNA全長618bp，共編碼205個氨基酸，含有一個完整的閱讀框。
　　2.栗疫菌蛋白激發(fā)子PECp1的生物信息學分析:采用DNA MAN、protaram、SOPMA等生物信息學分析軟件分析PECp1的理化性質和二級結構，結果表明，PECp1蛋白理論分子量為22291.51，等電點pI為4.621，該蛋白為親水性蛋白，并且不

4、穩(wěn)定;同源性分析表明該蛋白N端具有NAC蛋白家族的保守區(qū)，C端具有NAC中UBA的保守區(qū)，同時與細極鏈格孢菌激活蛋白PeaT1具有高達70％的同源性，二級結構分析表明該蛋白無跨膜區(qū)，并且沒有信號肽位點。
　　3.栗疫菌蛋白激發(fā)子PECp1表達載體的構建和優(yōu)化表達:在引物兩端添加EcoRⅠ和NdeⅠ酶切位點，將栗疫菌蛋白激發(fā)子PECp1連入到表達載體pET-28a中進行原核表達，可溶性分析表明栗疫菌蛋白激發(fā)子屬于可溶蛋白，采用自動誘

5、導和IPTG誘導兩種方法進行蛋白的誘導表達，結果表明，自動誘導培養(yǎng)基和IPTG兩種方法都夠能得到分子量大小約為40KD的融合蛋白;利用IPTG誘導蛋白表達時，IPTG濃度為0.5mM、溫度為30℃、誘導時間4h時，可以獲得表達量較高的蛋白，說明采用自動誘導培養(yǎng)基可以代替IPTG進行大規(guī)模誘導培養(yǎng)。
　　4.栗疫菌蛋白激發(fā)子PECp1的功能分析:采用不同濃度的重組蛋白對玉米、黃瓜、四季豆浸種后，分別測定重組蛋白對植物發(fā)芽、根系生長和

6、相關防御酶的影響。結果表明，不同濃度的重組蛋白對植物種子的發(fā)芽有不同的促進作用，其中對四季豆的影響最明顯，以稀釋300倍的效果最好，比對照提高了約70.5％;在根長方面，該蛋白能夠促進黃瓜和玉米根的生長;在幼苗的生長方面，栗疫菌激發(fā)子能夠促進植物幼苗的生長，但是其作用時間有一定的限制，6d后黃瓜和四季豆與對照相比無顯著差異;在根系活力和防御酶上，栗疫菌激發(fā)子重組蛋白能夠顯著提高玉米的根系活力、POD和CAT活性，與對照相比差異顯著，根系