日本七鰓鰻(Lampetra japonica)Lyb基因的克隆及脊椎動(dòng)物Y-box基因的系統(tǒng)發(fā)育分析.pdf

1、七鰓鰻作為現(xiàn)存最古老的脊椎動(dòng)物是聯(lián)系無(wú)脊椎動(dòng)物與脊椎動(dòng)物之間的重要物種，從遺傳信息基礎(chǔ)來(lái)看，它必定印記了無(wú)脊椎動(dòng)物的進(jìn)化歷史，在脊椎動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)育分析中有著十分重要的地位。Y-box基因是從細(xì)菌到人類(lèi)都廣泛存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是一類(lèi)與高度保守的順式作用元件CTGA-TTGGCCAA相互作用的負(fù)調(diào)控因子。它參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、翻譯調(diào)控、細(xì)胞增殖和再生、mRNA選擇性剪接、DNA的修復(fù)等。為更進(jìn)一步揭示脊椎動(dòng)物Y-box基因家族進(jìn)化，本文采用RT

2、-PCR和RACE技術(shù)，首先以本實(shí)驗(yàn)室已獲取的日本七鰓鰻唾液腺Y-box基因序列以及本實(shí)驗(yàn)室已有的日本七鰓鰻肝臟EST數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，克隆了日本七鰓鰻肝臟中的Y-box基因。進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)方法，對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的脊椎動(dòng)物Y-box蛋白序列以及經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的日本七鰓鰻Y-box蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，初步闡明了脊椎動(dòng)物Y-box基因的進(jìn)化機(jī)制。
　　 本文的主要研究結(jié)果如下：
　　 1)以本實(shí)驗(yàn)室已有的日

3、本七鰓鰻肝臟EST數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用cap3軟件對(duì)所獲得的EST序列進(jìn)行拼接，獲得拼接好的contig序列以及余下的未拼接上的單個(gè)片段，然后將所有的contig序列以及未拼接上的單個(gè)片段提交到DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行blast分析，從中找出與其它物種中Y-box基因相似性高的片段。
　　 2)根據(jù)預(yù)測(cè)得到的日本七鰓鰻肝臟中Y-box基因的部分片段設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR技術(shù)以及3’、5’RACE技術(shù)，從日本七鰓鰻肝臟中成功克隆出了y

4、-box基因，命名為lyb1，其cDNA全長(zhǎng)為1423bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?96bp，編碼331個(gè)氨基酸。
　　 3)基于實(shí)驗(yàn)室已獲得的日本七鰓鰻唾液腺Y-box基因lyb2設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR技術(shù)以及3’、5’RACE技術(shù)，從現(xiàn)存最古老的無(wú)頜類(lèi)脊椎動(dòng)物日本七鰓鰻(Lampetrajaponica)肝臟中克隆得到了相應(yīng)的Y-box基因，命名為lyb3,其cDNA全長(zhǎng)為726bp，其中開(kāi)放閱讀框?yàn)?46bp，編碼181個(gè)氨基酸

5、。
　　 4)運(yùn)用NJ法，對(duì)Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的其它物種的Y-box蛋白序列以及本實(shí)驗(yàn)獲得的日本七鰓鰻的Y-box蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Y-box基因的分化發(fā)生在有頜類(lèi)出現(xiàn)以后，在有頜類(lèi)出現(xiàn)以前只有一種類(lèi)型，有頜類(lèi)出現(xiàn)以后，Y-box基因分化成YB1、YB2和CSDA三種類(lèi)型。從整個(gè)進(jìn)化樹(shù)也可以看出日本七鰓鰻Y-box基因所在的位置與其物種的進(jìn)化地位是一致的，即處于脊椎動(dòng)物

6、最原始的位置。
　　 5)根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，將Y-box基因分成3組，即YB1、CSDA和YB2，用MEGA3.1軟件分別計(jì)算它們的非同義替換速率(dN)和同義替換速率(ds)及其比值(ω)。結(jié)果表明，YB1和CSDA的ω值小于1(P<0.01)，表示它們受到凈化選擇壓力作用，而YB2的ω則大于1，表示其受到正選擇壓力作用(P>0.01)。此外，在日本七鰓鰻中，三個(gè)Y-box基因也是受到凈化選擇壓力作用(P<0.05)。

7、
　　 綜上所述，本研究已在現(xiàn)存最原始的脊椎動(dòng)物日本七鰓鰻中克隆得到的3個(gè)Lyb基因，其均包含一個(gè)大約由70個(gè)氨基酸組成的保守的冷休克結(jié)構(gòu)域，表明日本七鰓鰻的Lyb基因均屬于Y-box基因家族。通過(guò)對(duì)脊椎動(dòng)物y-box基因的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，Y-box基因是在進(jìn)化過(guò)程中通過(guò)基因復(fù)制或選擇性剪接來(lái)產(chǎn)生直系同源基因與旁系同源基因，進(jìn)而使Y-box基因家族成為一個(gè)多功能的基因家族。通過(guò)進(jìn)化選擇壓力分析揭示，在復(fù)制產(chǎn)生的基因中，除Y-B