水飛薊賓抑制肝癌HepG2細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:本課題首先以人肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)細(xì)胞株(HepG2)為模型，探討水飛薊賓是否抑制HCC HepG2細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。其次，神經(jīng)鈣粘蛋白(N-cadherin)是惡性腫瘤細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)的重要標(biāo)志物。利用表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）建立細(xì)胞EMT模型，研究水飛薊賓是

2、否通過抑制N-cadherin的表達(dá)而逆轉(zhuǎn)EMT過程，進(jìn)而抑制HCC的轉(zhuǎn)移。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究水飛薊賓對(duì)N-cadherin相關(guān)的信號(hào)通路蛋白的影響。
　　方法:1.作用研究:采用MTT法觀察水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用;采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法觀察水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞遷移的作用;采用Transwell小室法檢測(cè)水飛薊賓對(duì)細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響;通過RT-PCR方法檢測(cè)遷移相關(guān)基因Twist、S

3、nail、Slug,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-11(MMP-11)和MMP-13的表達(dá)水平;采用單因素方差分析方法比較不同濃度水飛薊賓對(duì)細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移距離的和遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)的影響，并比較各組間Twist、Snail、Slug，VEGF、MMP-11和MMP-13的轉(zhuǎn)率，以p＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.機(jī)制研究:首先利用EGF建

4、立EMT模型。采用不同濃度(0，10，20ng/mL)的EGF誘導(dǎo)HCC HepG2細(xì)胞，觀察EGF誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)的變化;通過細(xì)胞劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力的變化;并通過RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)觀察N-cadherin、E鈣粘蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Ⅵmentin)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的變化。最后，通過Western Blot方法檢測(cè)水飛薊賓對(duì)N-cadherin的下游蛋白ERK、Akt和MMP-

5、9的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.作用研究:MTT檢測(cè)結(jié)果顯示不同濃度（30，60，120，240和480μg/ml）水飛薊賓可以抑制HepG2細(xì)胞增殖，抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴和時(shí)間依賴性(p＜0.05);細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，水飛薊賓干預(yù)組HepG2細(xì)胞的遷移與侵襲能力均減弱，且隨藥物劑量的增大而更弱;RT-PCR結(jié)果顯示，不同濃度的水飛薊賓可以顯著的降低HepG2細(xì)胞Twist、Snail和Slug基因的轉(zhuǎn)錄(p＜

6、0.05)，水飛薊賓可以不同程度下調(diào)VEGF和MMP-13的表達(dá)，但對(duì)MMP-11基因的轉(zhuǎn)率無顯著作用。
　　2.機(jī)制研究:EGF誘導(dǎo)后細(xì)胞向成纖維樣細(xì)胞形態(tài)改變;細(xì)胞劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均表明EGF能夠促進(jìn)HCC HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲能力;RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)也分別從mRNA水平和蛋白水平，進(jìn)一步說明EGF能夠上調(diào)EMT標(biāo)志物Vimemin和N-cadherin的表達(dá)，與對(duì)照組比較有顯著性差異(p＜0

7、.05)。但EGF沒有顯著下調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)。RT-PCR和Western Blot結(jié)果均說明，水飛薊賓干預(yù)可以明顯降低N-cadh-erin基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá);但對(duì)Vimentin基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)沒有明顯的作用。另外，Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水飛薊賓可以顯著下調(diào)ERK和AKT的表達(dá)(p＜0.05)，對(duì)MMP-9的表達(dá)無顯著作用。
　　結(jié)論:(1)水飛薊賓可抑制人HCC HepG2細(xì)胞的增殖，