肺炎衣原體感染通過促進(jìn)VE-鈣粘素磷酸化增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性而誘導(dǎo)單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移.pdf

1、目的：
　　利用肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae，C.pn）體外感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系Ea. hy926細(xì)胞模型，觀察C.pn感染對單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的影響，并從血管內(nèi)皮細(xì)胞（Vascular endothelial cell，VEC）通透性角度探討C.pn感染促進(jìn)單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的機(jī)制，證實(shí)C.pn感染可通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素（Vascular endothelial cadherin，VE-cadhe

2、rin）的酪氨酸磷酸化增加VEC的通透性，進(jìn)而誘導(dǎo)單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移。
　　方法：
　　1.免疫熒光法鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系Ea.hy926；
　　2.利用 Perco ll非連續(xù)性密度梯度離心法分離人血液中的單核細(xì)胞；跨內(nèi)皮遷移實(shí)驗(yàn)觀察C.pn感染對單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的影響；
　　3.跨內(nèi)皮電阻（Transendothelial electrical resistance，TEER）實(shí)驗(yàn)檢測C.pn感染對VEC

3、通透性的影響；
　　4.免疫熒光法觀察C.pn感染對VE-cadherin分布的影響；
　　5.采用Western blot技術(shù)檢測C.pn感染后VEC內(nèi)VE-cadherin總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平的變化；
　　6.利用免疫共沉淀技術(shù)提取Src結(jié)合蛋白，液閃計(jì)數(shù)儀檢測C.pn感染后Src激酶活性的改變；
　　7.用Src激酶選擇性抑制劑PP2預(yù)處理VEC后，Western blot檢測C.pn感染后VE-ca

4、dherin酪氨酸磷酸化水平的變化；
　　8.用PP2預(yù)處理VEC后，免疫熒光法觀察C.pn感染對VE-cadherin分布的影響；
　　9.用PP2預(yù)處理VEC后，利用TEER實(shí)驗(yàn)檢測C.pn感染對VEC通透性的影響；
　　10. PP2預(yù)處理VEC后，跨內(nèi)皮遷移實(shí)驗(yàn)觀察C.pn感染對單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的影響。
　　結(jié)果：
　　1.Ⅷ因子免疫熒光染色鑒定Ea. hy926細(xì)胞系，結(jié)果顯示，培養(yǎng)的Ea. h

5、y926細(xì)胞的胞漿呈綠色熒光，確定為VEC；
　　2.單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C.pn感染VEC24 h后，單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的數(shù)目明顯多于正常對照組（P<0.05）；
　　3. TEER實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C.pn感染VEC后，TEER值呈時(shí)間依賴性下降；感染后12 h至24 h下降速度加快，感染后24 h的TEER值明顯低于正常對照組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　4.共聚焦顯微鏡觀察，正常對照組的V

6、E-cadherin均勻分布于細(xì)胞與細(xì)胞連接處，為連續(xù)不間斷的狀態(tài)；C.pn感染VEC24 h后，VE-cadherin在胞膜上的表達(dá)下降，而在胞漿分布增多，呈彌散分布，細(xì)胞與細(xì)胞連接處出現(xiàn)明顯縫隙；
　　5. Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C.pn感染VEC后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的VE-cadherin總蛋白表達(dá)水平與0 h比較無明顯變化；而在感染24 h和48 h時(shí)，VE-cadherin（Y658）酪氨酸磷酸化水平均明顯高于正

7、常對照組（P<0.05），但感染后24 h和48 h之間的酪氨酸磷酸化水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　6.液閃計(jì)數(shù)儀檢測結(jié)果顯示，C.pn感染VEC12 h時(shí)Src激酶活性開始升高，至感染后24 h達(dá)到峰值；隨后開始下降，并持續(xù)至感染后48 h。感染后各時(shí)間點(diǎn)的Src激酶活性均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　7. Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C.pn感染VEC24 h時(shí)，VE-cadherin（Y6

8、58）的酪氨酸磷酸化水平明顯高于正常對照組，而 C.pn感染+ PP2組的VE-cadherin（Y658）酪氨酸磷酸化水平與單純C.pn感染組相比卻明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　8.共聚焦顯微鏡觀察到，PP2預(yù)處理 VEC后可抑制 C.pn感染引起的VE-cadherin由胞膜向胞漿的分布，并使細(xì)胞間連接處的縫隙減小。
　　9. TEER實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C.pn感染可降低VEC的TEER值，且呈時(shí)間依賴性

9、。PP2預(yù)處理后，VEC的TEER值下降趨緩（P<0.05）；
　　10.單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：C.pn感染VEC24 h時(shí)，單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的數(shù)目明顯高于正常對照組（P<0.05），而C.pn感染+PP2組的單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移數(shù)則顯著低于單純C.pn感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　C.pn感染可能通過激活Src激酶促使VE-cadherin（Y658）發(fā)生酪氨酸磷酸化以增加VE