晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高的作用機(jī)制.pdf

1、目的：本課題以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304及原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為對(duì)象，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞免疫組化、單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性的測(cè)定等方法觀察不同濃度和不同作用時(shí)間的晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞骨架形態(tài)和功能的影響。通過(guò)上述研究試圖闡明AGEs對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響以及可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為進(jìn)一步闡明與AGEs相關(guān)的動(dòng)脈硬化及糖尿病血管并發(fā)癥等多種心血管疾病的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為其防治提供新的思路和有效手段。

2、 方法：AGE修飾的人血清白蛋白，由人血清白蛋白與葡萄糖共孵育6周制得。內(nèi)皮細(xì)胞分別接種于微孔小皿和鋪有1％明膠的雙層通透的培養(yǎng)皿頂層小室微孔膜上(直徑6.5mm，孔徑大小0.4μm)，待細(xì)胞長(zhǎng)至融合后，換無(wú)血清培養(yǎng)基使細(xì)胞獲得同步生長(zhǎng)。用不同濃度的AGEs與人內(nèi)皮細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)不同時(shí)間，并設(shè)立HSA陰性對(duì)照組進(jìn)行比較。在各實(shí)驗(yàn)分組中，分別利用可溶性RAGE的抗體、NADPH氧化酶抑制劑、ERK通路抑制劑PD98059、p3

3、8抑制劑SB203580及JNK通路抑制劑SP600125，預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞；另外，利用重組腺病毒MEK1，MKK6b，p38α，MKK7的無(wú)活性型突變體預(yù)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，均繼以AGEs再孵育8h。采用熒光染色法觀察細(xì)胞骨架蛋白的形態(tài)學(xué)改變，羅丹明—鬼筆環(huán)肽或FITC—鬼筆環(huán)肽，俄勒岡綠標(biāo)記的G-actin特異性結(jié)合物DNA酶I；TRITC熒光標(biāo)記白蛋白漏出法測(cè)定單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透系數(shù)Pa值。 結(jié)論： 1.實(shí)驗(yàn)證明，AGE-

4、HSA以時(shí)間和劑量依賴的方式引起細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白F-actin和G-actin形態(tài)的改變及單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性的升高。 2.可溶性RAGE的抗體可阻抑AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架改變和單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性升高，提示AGE-RAGE的結(jié)合在轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)入細(xì)胞的過(guò)程中起重要作用。 3.NADPH氧化酶抑制劑可阻抑AGEs引起的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，提示氧化應(yīng)激參與了這一病理過(guò)程。 4.ERK和p38MAPK參與了AGEs介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞