晚期糖基化終產(chǎn)物誘導內(nèi)皮細胞通透性增高的作用機制.pdf

1、目的：本課題以人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304及原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)為對象，應用細胞培養(yǎng)、細胞免疫組化、單層內(nèi)皮細胞通透性的測定等方法觀察不同濃度和不同作用時間的晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)對內(nèi)皮細胞骨架形態(tài)和功能的影響。通過上述研究試圖闡明AGEs對血管內(nèi)皮細胞的影響以及可能的信號轉(zhuǎn)導通路，為進一步闡明與AGEs相關的動脈硬化及糖尿病血管并發(fā)癥等多種心血管疾病的發(fā)生機制提供實驗依據(jù)，并為其防治提供新的思路和有效手段。

2、 方法：AGE修飾的人血清白蛋白，由人血清白蛋白與葡萄糖共孵育6周制得。內(nèi)皮細胞分別接種于微孔小皿和鋪有1％明膠的雙層通透的培養(yǎng)皿頂層小室微孔膜上(直徑6.5mm，孔徑大小0.4μm)，待細胞長至融合后，換無血清培養(yǎng)基使細胞獲得同步生長。用不同濃度的AGEs與人內(nèi)皮細胞在體外共同培養(yǎng)不同時間，并設立HSA陰性對照組進行比較。在各實驗分組中，分別利用可溶性RAGE的抗體、NADPH氧化酶抑制劑、ERK通路抑制劑PD98059、p3

3、8抑制劑SB203580及JNK通路抑制劑SP600125，預處理內(nèi)皮細胞；另外，利用重組腺病毒MEK1，MKK6b，p38α，MKK7的無活性型突變體預轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞，均繼以AGEs再孵育8h。采用熒光染色法觀察細胞骨架蛋白的形態(tài)學改變，羅丹明—鬼筆環(huán)肽或FITC—鬼筆環(huán)肽，俄勒岡綠標記的G-actin特異性結合物DNA酶I；TRITC熒光標記白蛋白漏出法測定單層內(nèi)皮細胞的通透系數(shù)Pa值。 結論： 1.實驗證明，AGE-

4、HSA以時間和劑量依賴的方式引起細胞骨架肌動蛋白F-actin和G-actin形態(tài)的改變及單層內(nèi)皮細胞通透性的升高。 2.可溶性RAGE的抗體可阻抑AGEs誘導的細胞骨架改變和單層內(nèi)皮細胞通透性升高，提示AGE-RAGE的結合在轉(zhuǎn)導信號入細胞的過程中起重要作用。 3.NADPH氧化酶抑制劑可阻抑AGEs引起的內(nèi)皮細胞功能障礙，提示氧化應激參與了這一病理過程。 4.ERK和p38MAPK參與了AGEs介導的內(nèi)皮細胞