黃連素對(duì)肺炎衣原體感染誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、血管新生的拮抗作用及其相關(guān)分子機(jī)制.pdf

1、目的:建立肺炎衣原體(C.pn)體外感染血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)的模型；觀察C.pn在VEC中的發(fā)育周期及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；觀察黃連素對(duì)C.pn感染誘導(dǎo)的VEC遷移及血管新生的干預(yù)作用,初步探討其相關(guān)分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.利用HEp-2細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)C.pn AR-39株,用純化的C.pn感染VEC,光鏡下觀察細(xì)胞病變,PCR鑒定c.pn DNA特異性片段,確定C.pn感染VEC成功；
　　 2.吖

2、啶橙(AO)染色熒光顯微鏡下觀察感染24 h、48 h和72 h后,VEC內(nèi)C.pn包涵體狀態(tài)；
　　 3.透射電鏡下觀察感染24 h、48 h和72 h后,C.pn包涵體與VEC的超微結(jié)構(gòu)變化；
　　 4.應(yīng)用Wound-healing實(shí)驗(yàn)觀察C.pn感染的VEC于二維水平上的遷移變化情況,及不同濃度黃連素對(duì)其干預(yù)作用；
　　 5.應(yīng)用Transwdl實(shí)驗(yàn)觀察C.pn感染的VEC于三維水平上的遷移變化情況,及不

3、同濃度黃連素對(duì)其干預(yù)作用；
　　 6.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)C.pn感染的VEC MMP-1、MMP-9的分泌水平,及不同濃度黃連素對(duì)其干預(yù)作用；
　　 7.應(yīng)用Capillary tube formation實(shí)驗(yàn)觀察C.pn感染的VEC形成新生血管能力的變化,及不同濃度黃連素對(duì)其干預(yù)作用；
　　 8.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)C.pn感染后,VEC胞內(nèi)信號(hào)蛋白P13KmRNA表達(dá)水平的變化,及不同濃度黃連素對(duì)其

4、影響；
　　 9.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)C.pn感染后,VEC胞內(nèi)信號(hào)蛋白P13K酶活性水平的變化,及不同濃度黃連素對(duì)其影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn),C.pn感染后的VEC內(nèi)有空泡狀C.pn包涵體,PCR鑒定獲得C.pnDNA特異性片段,C.pn感染VEC模型成功建立；
　　 2.AO染色熒光顯微鏡下可見(jiàn),C.pn感染24 h后,VEC胞內(nèi)可見(jiàn)C.pn包涵體；感染48 h后,VEC胞內(nèi)

5、C.pn包涵體數(shù)量增加；感染72 h后,VEC崩解壞死,C.pn包涵體開(kāi)始釋放至胞外；
　　 3.透射電鏡下可見(jiàn),感染24 h后,VEC內(nèi)出現(xiàn)C.pn包涵體；感染48 h后,胞內(nèi)出現(xiàn)大量含電子致密物的C.pn原體,及呈膜泡樣的C.pn網(wǎng)狀體等C.pn特征性超微結(jié)構(gòu),VEC粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；感染72 h后,C.pn包涵體明顯增多,VEC崩解壞死,C.pn包涵體開(kāi)始釋放至胞外；
　　 4.C.vn感染24 h、48 h和72

6、h后,二維水平上感染組VEC遷移能力均明顯增強(qiáng),呈時(shí)間依賴(lài)性；P13K特異性抑制劑LY294002處理組VEC遷移能力明顯減弱；中、高劑量黃連素對(duì)C.pn感染誘導(dǎo)的VEC遷移具有明顯抑制作用,呈濃度依賴(lài)性；
　　 5.C.pn感染72 h后,三維水平上感染組VEC遷移能力明顯增強(qiáng),LY294002組VEC遷移能力明顯減弱,低、中、高劑量黃連素對(duì)C.pn感染誘導(dǎo)的VEC遷移均有明顯抑制作用,且隨著濃度升高抑制作用增強(qiáng),呈濃度依賴(lài)性

7、；
　　 6.C.pn感染24h、48 h和72h后,MMP-1、MMP-9分泌水平均無(wú)顯著性差異,LY294002及各劑量黃連素均未使兩者分泌水平明顯改變；
　　 7.C.pn感染72 h后,VEC形成微管腔結(jié)構(gòu)的能力明顯增強(qiáng),LY294002可使之減弱,低、中、高劑量黃連素對(duì)C.pn感染誘導(dǎo)的微管腔形成均有明顯抑制作用,且隨著濃度升高抑制作用增強(qiáng),呈劑量依賴(lài)性；
　　 8.C.pn感染72h后,P13KmRN

8、A表達(dá)水平顯著升高,酶活性亦明顯增強(qiáng)；LY294002可使其表達(dá)水平降低,酶活性減弱；中、高劑量黃連素可使C.pn感染后P13K mRNA表達(dá)水平與酶活性均明顯降低；VEC遷移、微管腔形成的程度與P13K mRNA表達(dá)水平(r1,r2)、酶活性(r1’,r2’)均呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論:C.pn感染可能是通過(guò)激活P13K誘導(dǎo)VEC遷移進(jìn)而促進(jìn)血管新生,而并非通過(guò)MMP-1、MMP-9的基質(zhì)降解途徑；黃連素可拮抗C.pn感染誘導(dǎo)的