小鼠鞘內(nèi)注射rAAV9載體介導(dǎo)跨區(qū)神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛轉(zhuǎn)基因表達(dá).pdf

1、目的:通過(guò)導(dǎo)入治療性基因來(lái)治療人類疾病的思想始于二十世紀(jì)七十年代，隨后發(fā)現(xiàn)病毒可作為基因治療的載體。理想的病毒載體必須具備三個(gè)特性:一是對(duì)目標(biāo)組織的高親和性和高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及對(duì)非目標(biāo)細(xì)胞、組織和器官的低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。二是該病毒載體可以在一段時(shí)間內(nèi)以持續(xù)的、具治療作用的水平表達(dá)。第三也是最重要的，就是病毒載體相關(guān)的副作用如致病性及機(jī)體免疫反應(yīng)最小。
　　腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus，AAV)是依賴病毒屬細(xì)小病毒科

2、的一種。細(xì)小病毒屬是一種非自主性病毒，需要與其他病毒共同感染以使其表達(dá)，并且無(wú)致病性，它的這些生物特性大大降低了AAV作為基因治療載體的副作用。重組腺相關(guān)病毒(recombinant AAV, rAAV)因其安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣、免疫源性低，在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一，目前已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床研究。rAAV能介導(dǎo)目的基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的表

3、達(dá)。rAAV9為rAAV家族中的一員，有研究證實(shí)rAAV9能透過(guò)血腦屏障，并在腦和脊髓內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)目的基因，故在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療中rAAV9的優(yōu)勢(shì)明顯。
　　基因治療的關(guān)鍵是轉(zhuǎn)基因要被輸送到足夠數(shù)量的疾病受累細(xì)胞中。不同的注射方式所引起的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的分布及所需病毒量不同。實(shí)質(zhì)內(nèi)注射可轉(zhuǎn)導(dǎo)注射局部，但對(duì)于病變范圍累及脊髓全長(zhǎng)、腦干及皮層的肌萎縮側(cè)索硬化并不適用。靜脈內(nèi)注射rAAV9雖可轉(zhuǎn)導(dǎo)新生小鼠CNS的廣泛區(qū)域，但對(duì)成年

4、小鼠CNS轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低，且存在靶向性不強(qiáng)、載體需求量大及潛在的安全性問(wèn)題。腦脊液內(nèi)注射rAAV載體沒(méi)有血腦屏障的阻礙，直接與CNS接觸。主要途徑包括腦室內(nèi)注射、小腦延髓池注射和鞘內(nèi)注射，其中鞘內(nèi)注射對(duì)脊髓的轉(zhuǎn)導(dǎo)更具優(yōu)勢(shì)，是沒(méi)有創(chuàng)傷的基因治療給藥方法。有研究者應(yīng)用小鼠鞘內(nèi)置管注射或直接腰椎穿刺的方法研究了rAAV載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，但存在的共同問(wèn)題是不同個(gè)體間轉(zhuǎn)導(dǎo)程度和范圍變異較大，作者認(rèn)為與操作者置管及注射成功與否的不確定性有關(guān)。直接

5、腰穿鞘內(nèi)注射相對(duì)于鞘內(nèi)置管更安全、無(wú)創(chuàng)且簡(jiǎn)便可行，但同時(shí)存在小動(dòng)物固有的技術(shù)難度。操作者直接鞘內(nèi)注射的成功程度不同將導(dǎo)致個(gè)體間轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及臨床效果的巨大差異。因此，需要一種無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)單、可控性強(qiáng)的廣泛CNS轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。
　　本實(shí)驗(yàn)針對(duì)小鼠腰椎穿刺鞘內(nèi)注射的盲目性，建立了對(duì)鞘內(nèi)注射效果的簡(jiǎn)單、有效的即時(shí)評(píng)估系統(tǒng)。利用改良的小鼠直接鞘內(nèi)注射法將rAAV9-CB6-EGFP注射入椎大池部位的腦脊液(cerebrospinal fluid，CS

6、F)中，研究rAAV9載體介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)范圍、效率及細(xì)胞類型。
　　方法:
　　1小鼠鞘內(nèi)注射法
　　雄性8-10周齡FVB小鼠18只，分為對(duì)照組6只及實(shí)驗(yàn)組12只。小鼠清醒狀態(tài)下分別腰椎穿刺法注射PBS或rAAV9-CB6-EGFP載體(4×1010GC)8ul（含1％利多卡因），記錄注射后小鼠四肢無(wú)力及癱瘓情況，三周后新鮮或4％多聚甲醛灌流固定取材。
　　2免疫組織化學(xué)法
　　4％多聚甲醛固定的

7、腦和脊髓組織經(jīng)振動(dòng)切片機(jī)切成厚20μm切片，0.01M PBS溶液漂洗;3％H2O2浸泡，封閉組織內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;0.3％tritonX-100穿孔;10％馬血清室溫封閉，分別加入抗GFP、抗GFAP及抗Iba1抗體，二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素依次孵育后，DAB染色，撈片，脫水，透明及封片。Olympus BX51顯微鏡觀察及照相。
　　3免疫熒光法
　　4％多聚甲醛固定的脊髓組織經(jīng)30％蔗糖/PBS溶液浸泡過(guò)夜

8、至組織沉底。冷凍環(huán)境下使用包埋劑OCT包埋組織，用冰凍切片機(jī)切成厚20μm切片，經(jīng)漂洗、穿孔、封閉、一抗(anti-GFP，anti-NeuN，anti-GFAP，anti-Iba1和anti-APC)、熒光二抗孵育并再次PBS漂洗后，抗熒光衰減封片劑封片，Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡觀察及照相。
　　4蛋白免疫印跡
　　小鼠經(jīng)麻醉后，新鮮取腰髓、頸髓、腦干、小腦、海馬、皮層和嗅球，液氮速凍后，-80℃保存待

9、用。提取組織總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。蛋白上樣30ug，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫脫脂奶粉封閉后，分別加一抗4℃搖床過(guò)夜。次日，加入熒光二抗，洗膜，Odyssey紅外掃描成像系統(tǒng)掃膜并分析結(jié)果。
　　5統(tǒng)計(jì)分析
　　計(jì)量資料用(x)±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。不同部位表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1根據(jù)

10、小鼠鞘內(nèi)注射后短暫肌無(wú)力表現(xiàn)分為5級(jí):1分，雙后肢輕度無(wú)力。2分，雙后肢中度無(wú)力，伴步態(tài)異常。3分，雙后肢癱瘓。4分，雙后肢癱瘓伴雙前肢無(wú)力。5分，四肢癱瘓伴呼吸受抑。評(píng)分4-5分為注射成功。18只注射的小鼠中有14只注射成功，成功率為77.8％。
　　2鞘內(nèi)注射PBS組小鼠脊髓GFP免疫組織化學(xué)染色呈陰性，rAAV9載體注射組小鼠脊髓GFP免疫組化染色呈不同程度陽(yáng)性，與注射后短暫肌無(wú)力評(píng)分呈明顯正相關(guān)。成功注射的小鼠脊髓GFP表

11、達(dá)明顯強(qiáng)于注射失敗小鼠，岡此通過(guò)注射后肌無(wú)力表現(xiàn)能預(yù)測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)效果。
　　3小鼠鞘內(nèi)注射rAAV9載體后，脊髓全長(zhǎng)均有轉(zhuǎn)基因表達(dá)，以前角、后角、前根發(fā)出區(qū)及后根傳入?yún)^(qū)域?yàn)橹?。腦干、小腦及前腦均可見不同程度、散在的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。GFP陽(yáng)性細(xì)胞以膠質(zhì)細(xì)胞為主，可見脊髓前角神經(jīng)元、小腦蒲肯野細(xì)胞、皮層及海馬神經(jīng)元的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
　　4免疫熒光顯示神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞均存在GFP表達(dá)。
　　5免

12、疫印跡顯示GFP在腰髓表達(dá)最高，其次是頸髓、嗅球、海馬和皮質(zhì)，腦干和小腦轉(zhuǎn)基因表達(dá)較低。
　　6成功轉(zhuǎn)導(dǎo)rAAV9載體的小鼠腰髓未見明顯小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:小鼠鞘內(nèi)注射rAAV載體簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)，通過(guò)加入利多卡因可有效地預(yù)測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率;rAAV9載體經(jīng)腰椎穿刺注入CSF后，在脊髓全長(zhǎng)及腦組織內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)范圍廣泛，且不引起明顯的神經(jīng)炎性反應(yīng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療中具