以原核顯微注射技術建立Csnk1ε轉基因小鼠及其表達檢測.pdf

1、酪蛋白激酶1(Casein Kinase1，Csnk1)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，已經(jīng)在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)并得到了7個Csnk1的同工酶，分別是Csnk1a、Csnk1b、Csnk1g1、Csnk1 g2、Csnk1g3、Csnk1d和Csnk1ε。相關研究表明，Csnk1ε的堿基缺失或突變可能對毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長具有一定影響。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種來源于細菌獲得性免疫的由RNA指導Cas蛋白對靶向基因進行修飾的技術。為深入研究Csn

2、k1ε對毛囊的作用，本實驗設計以CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導使得Csnk1ε定點整合于小鼠Rosa26位點上，再通過原核顯微注射技術技術，制備Csnk1ε轉基因小鼠。通過PCR及Southern Blot檢測方法鑒定陽性小鼠，并通過Real-time PCR，Western Blot方法對轉基因陽性小鼠進行表達檢測。
　　1、sgRNA載體及打靶載體構建
　　本實驗通過麻省理工學院的CRISPR Design軟件設計5對s

3、gRNA，以sgRNA-T2為模板，擴增得到相應的U6啟動子和sgRNA骨架載體，最終構建得到完整的sgRNA載體。打靶載體的構建是以人源K14啟動子，即皮膚特異性啟動子啟動目的基因，經(jīng)測序得知其同源性為98％。為了確保該啟動子的啟動功能，本實驗構建了以該啟動子啟動的紅色熒光蛋白表達載體pK14-DsRed，用以下一步細胞水平檢測。再利用同源重組技術原理在已經(jīng)確定的靶位點，即小鼠Rosa26第一內含子處，分別向上、下各取1kb左右作為打

4、靶載體的上、下游同源臂，最終將打靶載體構建成功。
　　2、細胞水平的相關檢測
　　本研究主要利用電穿孔轉染法將紅色熒光蛋白表達載體pCMV-DsRed導入MEF中，篩選出適應于MEF的最優(yōu)轉染條件，即160V/5Ms。利用該轉染條件將Cas9載體和sgRNA載體共同轉染于MEF中，培養(yǎng)48h后提取基因組，通過設計跨靶位點的PCR引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)雜交后再通過Surveyor突變檢測試劑盒進行鑒定，從而確定sgRN

5、A敲除位點為Rosa26基因的第一內含子的第1096bp處，其敲除效率為36.52％。同理，將構建好的人源K14啟動子啟動的紅色熒光蛋白表達載體pK14-DsRed，導入MEF中，通過觀察紅熒光的表達情況可知該啟動子具有啟動功能，可用于下一步實驗中。最后將hCas9載體、sgRNA載體及打靶載體共轉染于MEF中，進行PCR檢測，結果表明具備同源重組條件，可用于下一步轉基因打靶小鼠的建立，同時該檢測引物可用于轉基因陽性小鼠的檢測。

6、　　3、Csnk1ε轉基因小鼠的制備及鑒定
　　本研究將構建好的Csnk1ε打靶載體，根據(jù)同源重組技術原理，利用原核顯微注射法制備小鼠18只，通過PCR及Southern Blot鑒定后得到Csnk1ε隨機整合陽性小鼠1只，并未得到Csnk1ε定點整合的陽性小鼠。隨機整合陽性小鼠通過傳代得到F1代陽性小鼠1只，說明該轉基因陽性小鼠能夠將外源基因穩(wěn)定遺傳給予代。本實驗成功構建出Csnk1ε轉基因小鼠模型，為以后研究該基因的功能創(chuàng)造了

7、實驗條件。
　　4、Csnk1ε轉基因小鼠表達水平的檢測
　　本實驗首先對轉基因陽性小鼠進行了mRNA水平的檢測，以GAPDH為內參基因，通過Real-time PCR檢測結果為:轉基因陽性小鼠Csnk1εmRNA表達量是同窩對照小鼠的2.65倍。然后對其進行蛋白質水平的檢測，以α-tubulin為內參基因，通過Western Blot檢測結果是同窩對照小鼠的1.243倍。通過上述檢測手段，說明目的基因已經(jīng)成功轉入小鼠的基因